74.1

74. klonování savců včetně člověka

           Klonování DNA – fragment DNA získaný jakýmkoliv způsobem může být v laboratorních podmínkách zmnožen metodou, která se nazývá klonování DNA. Její podstata spočívá v tom, že daný fragment DNA je připojen na vektor (plazmid, bakteriofág, virus) a získaný hybridní plazmid je množen v bakterii E. coli. Přenos plazmidu do bakterií se provádí pomocí osmotického šoku, kterým se dočasně naruší stěna bakterií a umožní se přechod makromolekul do nitra bakterií. Je zřejmé, že pouze velmi malé procento takto ovlivněných bakterií přijme hybridní plazmid. To však není na překážku, neboť pomocí vhodného selekčního systému můžeme buňky s plazmidem namnožit v libovolném množství, přičemž všechny ostatní bakteriální buňky zahynou. Princip spočívá v tom, že původní kmen bakterií je citlivý na určité antibiotikum a vektor, který slouží k přenosu DNA, přenáší současně i rezistenci vůči tomuto antibiotiku. V přítomnosti antibiotika rostou tedy pouze bakterie, které mají začleněn vektor. Při množení bakterií se množí do ohromného množství i plazmid s fragmentem cizí DNA, kterou jsme na něj navázali. Po vypěstování dostatečného množství bakterií je třeba izolovat DNA, oddělit bakteriální DNA od plazmidové (na základě velkého rozdílu v molekulové hmotnosti je to snadné) a nakonec oddělit z plazmidové DNA ten fragment DNA, který jsme potřebovali namnožit. Výsledkem je, že máme dostatečné množství DNA, abychom mohli provádět další experimenty, např. určit pořadí bází. V takovém případě se hovoří o DNA knihovně.

           Klonování je podle běžné definice vytváření nového jedince geneticky identického (shodného) s předlohou. Tito dva jedinci se poté označují jako klony. Tento proces probíhá velice často v přírodě u rostlin i živočichů (především tzv. vegetativní rozmnožování, jímž mohou vzniknout např. i celé klonální topolové lesy). Klonování hraje dnes důležitou úlohu v zemědělství a biotechnologických oborech. Celkově lze říci, že klonování vyšších rostlin je jednodušší a rozšířenější, než klonování živočichů.

           Klonování dělením embryí – nejvíce se podobá klonování v přírodě (jednovaječná dvojčata). Pomocí mikroskopu a mikromanipulátoru lze rozdělit časné embryo na dvě části, ta se nechají vyvíjet v náhradních matkách a narodí se identická dvojčata. Použita u makaka a u lidských zárodků, které byly kvůli vývojovým defektům odsouzeny k abortům a časnému stádiu gravidity.

           Přenos jader (transplantace jader) – jádro dlouhodobě kultivované somatické buňky se vnese od enukleovaného oocytu. Přenášené jádro musí být ve fázi G0, buňka neriskuje rychlý vstup do S fáze. Cytoplast je ve fázi M a po přijetí jádra přechází do fáze S. fúze jádra a oocytu byla provedena elektrickými pulsy, ty destabilizují buněčnou membránu a dovolí buňkám spolu splynout a aktivují oocyt, který se začne vyvíjet – roslinská technika. Takto vznikla ovečka Dolly, měla tři matky (dárkyni jádra somatické buňky z mléčné žlázy, dárkyni oocytu pro přípravu cytoplastu, náhradní matku). Přenos „nahého“ jádra vyloupnutého z donorové buňky pomocí velmi jemné skleněné kapiláry a mikromanipulačního zařízení – honolulská technika. Výhody: do cytoplastu se nedostává příměs cytoplasmy a mikroinjekce nespustí okamžitý vývoj embya (možnost prodloužené klidové fáze, kdy se dokončí reprogramování). Vývoj zárodku později nastartován ionty strontia a zárodek se vyvíjí lépe než při roslinské technice.

           Tvorba chimér – má dobré perspektivy, je negací metody dělení embryí. Vznikají dokonalé kopie klonovaných jedinců v téměř neomezeném množství. Podstatou je agregace několika časných embryí v jediný zárodek, který je schopen dokončit svůj vývoj. Těla chimér jsou složena z buněk různého původu – ESC (emrbyonální kmenové buňky), tetraploidní kmenové buňky. poměr jednotlivých buněk embryí je náhodný. Spojení embryí je možné díky nejednoznačně vymezené identitě embryonálních buněk. Úspěšná pouze u myší.

           Klonování člověka

Reprodukční klonování – cílem je vytvoření živého lidského klonu. Ve většině demokratických zemí je zakázáno zákonem. Není přezkoumáno, co se u klonovaných embryí přesně odehrává.

Terapeutické klonování – zaměřené na boj s lidskými nemocemi (např. choroby srdce, mozku, genetické choroby). Z těla nemocného člověka jsou odebrány specializované somatické buňky a ty jsou přeneseny do enukleovaného oocytu – ze zárodku jsou vypěstovány embryonální kmenové buňky – široké využití. Při použití buněk pacienta je organizmus nevnímá jako cizí.

            Význam a využití – transgenní organismy – modely lidských chorob, funkce genů, buněčná terapie, regenerativní medicína, hospodářství – genetické vylepšení semen (produkce mléka, kvalita masa, růstové vlastnosti, reprodukce, odolnosti vůči chorobám), výzkum stárnutí, rakoviny a regulace buněčné proliferace.