71. mapování lidského
genomu (přehled metodických přístupů)
Mapování genomu určitého
organizmu je složitý proces. Pro co nejpřesnější představu o genové mapě
zkoumaného organismu musíme zjistit následující fakta: Kolik má organismus chromozomů,
na kterém chromozomu se jaký gen nachází, v jakém pořadí jsou geny na
chromozomu umístěny; jak jsou od sebe geny vzdáleny. V současné době je již
běžné i sekvenování genomů, což je proces, během kterého
zjistíme kompletní sekvenci nukleotidů jaderné molekuly DNA organismu.
Hybridomová metoda – Počet chromozomů lze stanovit běžnými mikroskopickými
technikami pomocí vhodného cytogenetického barvení. Složitější již je
umisťování genů na jednotlivé chromozomy. Za tímto účelem byly vyvinuty
speciální metody (hybridomová metoda), kdy se vytvářely buněčné kultury s
kombinovanou chromozomovou výbavou (například člověka a myši). V těchto
kulturách se postupně eliminovaly lidské chromozomy (nebo jejich části) a
vyhodnocovala se přítomnost produktu sledovaného v závislosti na zbylých
chromozomech (pokud v buňce zbyl pouze jeden lidský chromozom a produkt hledané
genu se stále tvořil, potom bylo možné tento gen lokalizovat na onen
chromozom). Tato metoda byla velmi zdlouhavá a vyžadovala velikou zkušenost.
Hybridizace DNA – dvouvláknovou DNA lze
reverzibilně denaturovat teplem – rozrušení vodíkových můstků mezi bázemi a
oddělení obou řetězců. V modifikaci DNA-RNA použito vlákno mRNA, označené
radioaktivním izotopem. Báze označená izotopem se hybridizuje s částí DNA,
kde je odpovědný strukturní gen. V modifikace DNA-cDNA použita cDNA sonda,
syntezována in vitro dle vzoru mRNA pomocí reverzní transkriptázy. Nově
syntezované vlákno je kopií daného genu. Pro diagnostické využití je třeba
získanou cDNA (copy) namnožit a znovu označit izotopem. Namnožení pomocí
inkorporace cDNA do vhodného plazmidu, který je v bakteriích klonován.
Plazmidy s cDNA pak použity jako sondy pro hybridizace DNA-cDNA na
chromozomech nebo restrikčních fragmentech DNA oddělených do plochy
elektroforézou. Metody jsou užívány k lokalizaci genů.
Project „HUGO“ – mapování celého
lidského genomu, patří mezi nejvíce diskutované projekty genového inženýrství. Tento
projekt, často nazývaný „projekt tisíciletí“, si vyžádá nejméně jednu miliardu
dolarů a předpokládá se, že na něm bude pracovat asi 5 000 kvalifikovaných
odborníků po dobu 20 let. Pro úspěšnou realizaci projektu mapování celého
lidského genomu je třeba nejprve vytvořit genetické mapy, potom fyzikální mapy
jednotlivých fragmentů DNA, a teprve potom je možné provést sekvenování.
Cíle – zkoumat povahu,
struktury, funkce a interakce genů, genetické elementy a genomy člověka
příslušných patogenních organismů. Charakterizovat povahu a vývoj genetické
variability u člověka a ostatních organismů. Studovat vliv genetické
variability a životního prostředí na vlastnosti, příčiny, léčbu a prevenci
chorob. Podporovat interakci, koordinaci a šíření informací a technologií mezi
širokou veřejnost v oblasti genomiky, proteomiky, bioinformatiky, biologie
systémů a klinických věd podporou kvalitního vzdělávání. Sponzorovat dialogy o
sociálních, právních a etických otázkách spojených s genetickými a
genomickými informacemi.
Mapa – značky na DNA
sekvenci (RFLP, VNTR), štěpení DNA na velké fragmenty se značkami, použití BAC
(bacterial artificial chromosome) (100 000-200 000 bp), knohovny
klonů – přístup „clone by clone“, jejich mapování na lidské chromozomy (DNA fingerprints,
FISH), kontigy (klony BAC knihovny), menší DNA fragmenty (cca 2 000 bp) –
fágy, sekvenace, sestavení a anotace, databáze.
Venter (Celera genomics)
a hugo –
„shotgun sequencing“ – sekvenování dlouhých fragmentů (chtěl na celý genom),
genom – náhodné fragmenty, sekvenace a sestavení pomocí „clone by clone“,
rychlejší účinné pokud je k dispozici reference, chyby.
Žádné komentáře:
Okomentovat