70.1

70. biologické principy identifikace osob založené na analýze DNA

            V rámci identifikace osob a určování příbuzenského poměru (viz testy otcovství níže) se využívá tzv. STR (Short Tandem Repeats) – krátkých tandemových repetic (někdy označované jako mikrosatelity). Jde o specifické sekvence DNA, které se vyskytují (ve velkém množství) rozptýlené v genomu. Jedná se o repetice (nejčastěji CA dvojice nukleotidů) jejichž počet opakování v konkrétním lokusu je pro každého jedince specifický. Konkrétní počet repetic se zjistí díky metodě PCR a následné elektroforéze fragmentů. Lze tedy vytvořit spolehlivý genetický profil jedince. Přesnost je velmi vysoká – hovoří o tom jak neoficiální název této metody (DNA fingerprinting – doslova genetické otisky prstů), tak skutečnost, že jde o soudy běžně uznávaný důkaz.

detekce rozdílů na úrovni: DNA, Biochemické: antigeny, Somatické: fenotyp, Odvozené od fenotypových projevů: písmo

- další rozdělení detekce: medicinské (před transfuzí a transplantací; nádor. onemocnění; monogenní onemocnění…)
nemedicinské (imigrace, paternitní spory, kriminalistika…)
- v soudním lékařství, evoluce člověka, populační rozdíly

            DNA fingerprinting – DNA fingerprinting je soubor metod, díky kterým lze určit totožnost osob z biologického vzorku na základě polymorfismů sekvencí vybraných úseků DNA. Tento způsob individuální identifikace je v dnešní době široce využíván jak v trestních případech (forenzní genetika), tak ve sporech občanskoprávních, zejména ve spojitosti s určováním rodičovství (paternitní spory). V obou případech výsledky DNA fingerprintingu často slouží jako hlavní důkazní materiál.

RFLP – Umožňuje rozlišení dvou jedinců podle dvou alel. Alela 1 nese rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu, alela 2 toto místo nenese. Je-li tedy genotyp podezřelého 1/1 a např. biologické stopy nalezené na místě činu genotypu 1/2 či 2/2. Může být podezřelý vyloučen. Protože ale mohou pro jednoduchý dvoualelový polymorfismus existovat pouze 3 různé genotypy, je diskriminační schopnost jednoho polymorfismu tohoto typu velmi malá. Proto je třeba využít variabilnějších polymorfismů a kombinovat výsledky vyšetření více lokusů. Tento fakt a potřeba relativně velkého množství kvalitní DNA spolu s časovou náročností vedou k tomu, že metoda RFLP není běžně užívána.

VNTR – Metoda, také nazývána multilokusový fingerprinting, je založena na detekci alel z mnoha různých VNTR z různých chromozomů. Po použití sondy získáme sérii různě intenzivních a různě vzdálených proužků. Kromě jednovaječných dvojčat není rozložení proužků u žádných dvou jedinců stejné. Při určování otcovství se zkoumá, zda-li multilokusový fingerprinting obsahuje stejné proužky jako fingerprinting otce. Pokud ano, dítě je skutečně jeho potomkem. Ovšem i této metodě stojí v cestě potřeba velkého množství kvalitní DNA pro použití Southernovy metody.

STR – Princip metody využívající krátkých tandemových repetic je stejný jako u VNTR. STR markery se ale využívají nejčastěji, a to především díky větší citlivosti a menší časové náročnosti.

- repetitivní tandemové sekvence na alelách tvoří základ polymorfismu DNA
Polymorfusmus= alela tak častá, že se nachází na více než 1 % chromozomů v populaci (vzácná varianta= méně než 1%)

polymorfismus v kodující DNA: může vést k polymorfismu na úrovni proteinu -onemocnění
nekódující DNA: užitečný marker (minisatelity,mikrosatelity, SNP)
SNP= single nukleotide polymorphism;minisatelit: opakování sekvence 10-100bp; mikrosatelit: opak 2-4 nukleotidů

- jedinci se též liší místy pro restrikční endonukleázy : způsobeno přítomností polymorfismů - mutace; dané fragmenty jsou kodominantní alely - detekce pomocí Southern blot……rozdělením pomocí restrikčních endonukleáz získáme tzv. DNA fingerprint
- sondy detekující minisatelity se využívají v kriminalistice, paternitních sporech, mapování lidských chromozomů, při ověřování hybridních buněk….

- mikrosatelity se měří pomocí PCR, primery hybridizují s oblastmi přiléhajícími k opakování; používá se tedy PCR,elfo; různá délka se projeví různou délkou PCR produktů

DNA profil= detekce více mikrosatelitů nebo minisatelitů - charakteristické pro danou osobu, výhoda malého vzorku, fluorescenčně značené primery, automatická detekce, digitální data, databáze.

- Typicky 4-6 polymorfismů zaznamená v jednom případě
Až 30 alel v lokusu= 200-400 genotypů
Pro 6 markerů 4 triliony možných kombinací
Nahrazováno PCR detekcí STR

- polymorfismy v kódujících oblastech: stanovení krevních skupin
stanovení sérových proteinů
stanovení izoenzymových variant
stanovení antigenních specifik HLA systému

Dále sem můžete zahrnout: dědičnost krevních skupin ; dědičnost HLA systémů