7. Transport látek uvnitř
buňky, fúze biomembrán, vezikulární transport
BUNĚČNÉ POHYBY - ROZDĚLENÍ
Pohyb umožňuje udržovat jednak vnitřní integritu živých soustav, jednak jejich účelné chování vůči okolí. U eukaryontních buněk pohyb realizuje cytoskeletální soustava, která je schopna transformovat chemickou energii v energii pohybovou. Z hlediska účelu lze pohyby buněk rozdělit do 2 skupin:
1) Aktivní pohyb vůči okolí, tj. lokomoce, jejímž cílem je účelné chování buňky vůči okolí. Pohyb bičíkový a řasinkový je zprostředkovaný mikrotubuly, pohyb améboidní hlavně mikrofilamenty. U řasinkových epitelů sice nejde o pohyb samotné buňky, ale mechanismus pohybu řasinek je stejný jako např. u prvoků. Zvláštním druhem pohybu je pohyb svalový, který se lokomočně manifestuje až na úrovni mnohobuněčných živočichů. Z hlediska samotné svalové buňky jde o změnu tvaru buňky, tj. o kontrakci v jednom směru.
2) Vnitrobuněčné pohyby, jejichž cílem je dynamická změna lokalizace buněčných struktur s ohledem na jejich specializované funkce. Patří sem transport membránových struktur, přesuny buněčných organel, axonový transport i pohyb chromozómů při mitóze a meióze – u těchto pohybů se uplatňují především mikrotubuly. Mikrofilamenta se podílejí hlavně na rotaci (cyklóze) cytoplazmy buněk, na cytokinezi, nebo na rozprostírání buněk při jejich pěstování in vitro ve stacionární kultuře.
MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY POHYBU BUNĚK
Pohyb umožňuje udržovat jednak vnitřní integritu živých soustav, jednak jejich účelné chování vůči okolí. U eukaryontních buněk pohyb realizuje cytoskeletální soustava, která je schopna transformovat chemickou energii v energii pohybovou. Z hlediska účelu lze pohyby buněk rozdělit do 2 skupin:
1) Aktivní pohyb vůči okolí, tj. lokomoce, jejímž cílem je účelné chování buňky vůči okolí. Pohyb bičíkový a řasinkový je zprostředkovaný mikrotubuly, pohyb améboidní hlavně mikrofilamenty. U řasinkových epitelů sice nejde o pohyb samotné buňky, ale mechanismus pohybu řasinek je stejný jako např. u prvoků. Zvláštním druhem pohybu je pohyb svalový, který se lokomočně manifestuje až na úrovni mnohobuněčných živočichů. Z hlediska samotné svalové buňky jde o změnu tvaru buňky, tj. o kontrakci v jednom směru.
2) Vnitrobuněčné pohyby, jejichž cílem je dynamická změna lokalizace buněčných struktur s ohledem na jejich specializované funkce. Patří sem transport membránových struktur, přesuny buněčných organel, axonový transport i pohyb chromozómů při mitóze a meióze – u těchto pohybů se uplatňují především mikrotubuly. Mikrofilamenta se podílejí hlavně na rotaci (cyklóze) cytoplazmy buněk, na cytokinezi, nebo na rozprostírání buněk při jejich pěstování in vitro ve stacionární kultuře.
MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY POHYBU BUNĚK
Cytoskeletální soustava zajišťuje buněčné pohyby prostřednictvím
asociovaných proteinů mikrotubulů a mikrofilament, tzv. molekulových motorů.
Zdrojem energie je hydrolýza ATP nebo GTP. Jejich obecná struktura je stejná –
motorová doména ve tvaru hlavičky má ATPázovou aktivitu – kontaktem hlavičky s
cytoskeletální strukturou se ATP hydrolyzuje a změní se konformace hlavičky,
což se projeví jejím posunem po mikrotubulu nebo mikrofilamentu. Koncová doména
má vazebná místa pro jiné molekuly či buněčné struktury. V případě, že
cytoskeletální struktura je k nějaké jiné struktuře fixována, molekulový motor
se pohybuje po ní; naopak je-li motorový protein fixován koncovou doménou k
nějaké struktuře, pak molekulový motor pohybuje cytoskeletální strukturou
(např. klouzání mikrotubulů). V omezené míře buňka může realizovat kinetické
funkce i řízenou a prostorově orientovanou polymerací a depolymerací
mikrotubulů a mikrofilament.
VNITROBUNĚČNÝ TRANSPORT
Proudění (cirkulace) cytoplazmy – cyklóza
Cirkulace cytoplazmy, jev zprostředkovaný funkcí mikrofilament a závislý na dodání energie, je již dlouho známý u řady živočišných i rostlinných buněk. Je blokována mikrofilamentárními jedy. Molekulární mechanismus je pravděpodobně stejný jako u améboidního pohybu.
Nejznámějším typem cirkulace cytoplazmy je cyklóza u rostlinných buněk. Jednosměrný pohyb vrstvy cytoplazmy mezi membránou a vakuolou je pozorovatelný podle pohybu přítomných chloroplastů. Jednosměrnost pohybu je dána polaritou mikrofilament – buněčné organely putují podél svazků mikrofilament vždy v opačném směru než je jejich polarita.
Transport membránových struktur a organel
Při migraci pigmentových zrn v melanocytech se uplatňují mikrotubuly, které většinou vyzařují radiálně k periferii buňky a mají všechny stejnou polaritu, tj. +konec směřuje k periferii buňky. Rychlost pohybu pigmentových zrn k periferii je asi 5 mikrom/sec, ale agregace směrem k jádru je rychlejší, asi 20 mikrom/sec. Transport oběma směry lze rušit mikrotubulárními toxiny, nikoliv cytochalaziny. Centrifugální pohyb zrn indukuje kofein, centripetální pohyb epinefrin. Přesný molekulární mechanismus těchto pohybů není zcela objasněn. Roli zde hraje kinesin určující jednosměrný pohyb mikrotubulů od -konce k +konci. Pro opačný pohyb snad existuje jiný translokátor podobný dyneinu.
K nitrobuněčným pohybům patří také pohyb chromozomů při mitóze a meióze (karyogeneze), který je zprostředkován mikrotubuly dělícího vřeténka. Jestliže dojde k poruše dělícího vřeténka, např. působením kolchicinu, zastaví se dělení, chromozomy se nerozejdou do dceřiných buněk. Pokud se chromozomy nemohou vůbec rozejít, může vzniknout tetraploidní buňka, jedná-li se o jednotlivé chromozomy, jejichž centromery se v anafázi nerozejdou, vzniká aneuploidní buňka. Totéž může nastat, jestliže se některé chromozomy zpozdí během anafáze (tzv. anafázické zbrždění), a nejsou začleněny do vznikajícího dceřiného jádra.
Na dělení cytoplazmy (cytokinezi) při buněčném dělení se u živočichů podílejí mikrofilamenta – tzv. kontraktilní prstenec. Jestliže již došlo k rozdělení jádra – karyokinezi, ale v důsledku poruchy funkce mikrofilament nenastala cytokineze, může vzniknout vícejaderná buňka.
VNITROBUNĚČNÝ TRANSPORT
Proudění (cirkulace) cytoplazmy – cyklóza
Cirkulace cytoplazmy, jev zprostředkovaný funkcí mikrofilament a závislý na dodání energie, je již dlouho známý u řady živočišných i rostlinných buněk. Je blokována mikrofilamentárními jedy. Molekulární mechanismus je pravděpodobně stejný jako u améboidního pohybu.
Nejznámějším typem cirkulace cytoplazmy je cyklóza u rostlinných buněk. Jednosměrný pohyb vrstvy cytoplazmy mezi membránou a vakuolou je pozorovatelný podle pohybu přítomných chloroplastů. Jednosměrnost pohybu je dána polaritou mikrofilament – buněčné organely putují podél svazků mikrofilament vždy v opačném směru než je jejich polarita.
Transport membránových struktur a organel
Při migraci pigmentových zrn v melanocytech se uplatňují mikrotubuly, které většinou vyzařují radiálně k periferii buňky a mají všechny stejnou polaritu, tj. +konec směřuje k periferii buňky. Rychlost pohybu pigmentových zrn k periferii je asi 5 mikrom/sec, ale agregace směrem k jádru je rychlejší, asi 20 mikrom/sec. Transport oběma směry lze rušit mikrotubulárními toxiny, nikoliv cytochalaziny. Centrifugální pohyb zrn indukuje kofein, centripetální pohyb epinefrin. Přesný molekulární mechanismus těchto pohybů není zcela objasněn. Roli zde hraje kinesin určující jednosměrný pohyb mikrotubulů od -konce k +konci. Pro opačný pohyb snad existuje jiný translokátor podobný dyneinu.
K nitrobuněčným pohybům patří také pohyb chromozomů při mitóze a meióze (karyogeneze), který je zprostředkován mikrotubuly dělícího vřeténka. Jestliže dojde k poruše dělícího vřeténka, např. působením kolchicinu, zastaví se dělení, chromozomy se nerozejdou do dceřiných buněk. Pokud se chromozomy nemohou vůbec rozejít, může vzniknout tetraploidní buňka, jedná-li se o jednotlivé chromozomy, jejichž centromery se v anafázi nerozejdou, vzniká aneuploidní buňka. Totéž může nastat, jestliže se některé chromozomy zpozdí během anafáze (tzv. anafázické zbrždění), a nejsou začleněny do vznikajícího dceřiného jádra.
Na dělení cytoplazmy (cytokinezi) při buněčném dělení se u živočichů podílejí mikrofilamenta – tzv. kontraktilní prstenec. Jestliže již došlo k rozdělení jádra – karyokinezi, ale v důsledku poruchy funkce mikrofilament nenastala cytokineze, může vzniknout vícejaderná buňka.
Fúze biomembrán
Základem buněčných fúzí je fúze cytoplazmatických membrán. Tato schopnost
membrán vychází z jejich fluidního charakteru. Pokud se naruší integrita
fosfolipidového bimolekulárního filmu membrány, uvolněné fosfolipidy
vytvářejí micely. V nich se molekuly fosfolipidů orientují svými
hydrofobními konci směrem do centra micely. Micelární struktura je přechodná,
po čase seřazením micel se obnoví původní dvojvrstva lipidů. Někdy však při
této rekonstrukci membrán sousedních buněk může dojít k vytvoření
cytoplazmatického můstku, kterým se buňky spojí v jednu. Fúze buněk se někdy
označuje i jako somatická hybridizace (na rozdíl od
hybridizace gametické, při které splývají gamety).
V mnohobuněčném organismu se můžeme setkat se splýváním buněk při diferenciačních procesech (splývání myoblastů ve svalové vlákno – myotubu) nebo při tvorbě trofoblastu. Také nádorové buňky mají schopnost snadno splývat. = spontánní fúze
Od 60. let byly prováděny pokusy s indukovanými fúzemi, přičemž živočišné buňky mohou fúzovat přímo, v přítomnosti buněčné stěny se musí tato nejprve odstranit, a pak fúzují protoplasty (např. u rostlin). Většina fuzogenních faktorů, tzv. fuzogenů, vyvolává narušení struktury cytoplazmatické membrány v místě kontaktu sousedních buněk a v těchto místech pak buňky mohou snadno splynout.
Fuzogeny mohou být povahy:
• biologické - např. Sendai virus a jiné paramyxoviry,
• fyzikální - pulsy elektrického proudu o vysokém napětí nebo
• chemické - polyethylenglykol (PEG).
Původně se PEG používal k extrakci proteinů a právě tato jeho vlastnost se využívá při fúzování – narušuje strukturu membrány, která se stává značně viskózní. PEG proniká do buňky a zvyšuje propustnost membrány pro Ca2+ ionty, což také mění viskozitu cytoplazmy. Pomocí PEGu je možné fúzovat prakticky všechny typy buněk, dokonce i rostlinné spolu s lidskými.
Splývání buněk (obr. 4) se objevuje již během 5 – 10 minut po opětném odstranění PEGu (nechává se působit jen 60 sekund). Nejprve vznikají mezi sousedními buňkami cytoplazmatické můstky, které se později rozšiřují. Z mikrokinematografických záznamů vyplynulo, že vlastní splynutí cytoplazmy obou buněk a pohyb jader k sobě trvá asi 15 – 40 minut. Cytoplazmatické můstky se mohou v kultuře buněk vytvořit prakticky na kterémkoliv místě cytoplazmatické membrány. Ovšem ne každý můstek musí nutně vést k fúzi buněk. Také se zjistilo, že maximum buněčných fúzí nastává v prvních 60 minutách po odstranění PEGu a celé období, kdy lze pozorovat vznik fúzí, trvá asi 2,5 hodiny.
Po splynutí cytoplazmy fúzujících buněk získáme nejprve buňku s více jádry - tzv. polykaryon, splývají-li buňky téhož druhu (obr. 5), nebo heterokaryon, když splývají buňky různých druhů. Teprve v další fázi, pokud zfúzovaná buňka projde buněčným cyklem, během něhož splynou i genomy do jednoho společného jádra, vzniká tzv. synkaryon.
Obvykle genomy zfúzovaných buněk nezůstanou kompletní, zpravidla rychle ubývá chromozómů jednoho z partnerů, zvláště pokud byly genomy málo příbuzné (mezirodové fúze). V důsledku somatického crossing-overu může dojít k rekombinaci genů obou genomů. Předpokládá se, že tato somatická hybridizace se mohla uplatnit i v evoluci genetické informace.
Somatická hybridizace se využívá při přípravě hybridomů pro výrobu monoklonálních protilátek, ale i při mapování lidských chromozómů. Např. se nechá fúzovat lidská buňka s myší, která je defektní mutantou. Pokud dojde k rekombinaci, může lidský chromozóm tento defekt v myším genomu kompenzovat. Jestliže fúzující buňky budeme pěstovat na selekčním médiu, budou se postupně z myších genomů eliminovat lidské chromozómy s výjimkou toho, který kompenzuje myší defekt. Tímto způsobem byly získány různé klony buněk nesoucích některé lidské geny na pozadí jiného genomu. Např. genový komplex kódující u člověka HLA systém byl takto lokalizován na 6. chromozomu. Fúze buněk a zejména fúze membránových váčků (tzv. liposomů) lze využít i v genovém inženýrství – slouží jako vektory pro přenos DNA.
V mnohobuněčném organismu se můžeme setkat se splýváním buněk při diferenciačních procesech (splývání myoblastů ve svalové vlákno – myotubu) nebo při tvorbě trofoblastu. Také nádorové buňky mají schopnost snadno splývat. = spontánní fúze
Od 60. let byly prováděny pokusy s indukovanými fúzemi, přičemž živočišné buňky mohou fúzovat přímo, v přítomnosti buněčné stěny se musí tato nejprve odstranit, a pak fúzují protoplasty (např. u rostlin). Většina fuzogenních faktorů, tzv. fuzogenů, vyvolává narušení struktury cytoplazmatické membrány v místě kontaktu sousedních buněk a v těchto místech pak buňky mohou snadno splynout.
Fuzogeny mohou být povahy:
• biologické - např. Sendai virus a jiné paramyxoviry,
• fyzikální - pulsy elektrického proudu o vysokém napětí nebo
• chemické - polyethylenglykol (PEG).
Původně se PEG používal k extrakci proteinů a právě tato jeho vlastnost se využívá při fúzování – narušuje strukturu membrány, která se stává značně viskózní. PEG proniká do buňky a zvyšuje propustnost membrány pro Ca2+ ionty, což také mění viskozitu cytoplazmy. Pomocí PEGu je možné fúzovat prakticky všechny typy buněk, dokonce i rostlinné spolu s lidskými.
Splývání buněk (obr. 4) se objevuje již během 5 – 10 minut po opětném odstranění PEGu (nechává se působit jen 60 sekund). Nejprve vznikají mezi sousedními buňkami cytoplazmatické můstky, které se později rozšiřují. Z mikrokinematografických záznamů vyplynulo, že vlastní splynutí cytoplazmy obou buněk a pohyb jader k sobě trvá asi 15 – 40 minut. Cytoplazmatické můstky se mohou v kultuře buněk vytvořit prakticky na kterémkoliv místě cytoplazmatické membrány. Ovšem ne každý můstek musí nutně vést k fúzi buněk. Také se zjistilo, že maximum buněčných fúzí nastává v prvních 60 minutách po odstranění PEGu a celé období, kdy lze pozorovat vznik fúzí, trvá asi 2,5 hodiny.
Po splynutí cytoplazmy fúzujících buněk získáme nejprve buňku s více jádry - tzv. polykaryon, splývají-li buňky téhož druhu (obr. 5), nebo heterokaryon, když splývají buňky různých druhů. Teprve v další fázi, pokud zfúzovaná buňka projde buněčným cyklem, během něhož splynou i genomy do jednoho společného jádra, vzniká tzv. synkaryon.
Obvykle genomy zfúzovaných buněk nezůstanou kompletní, zpravidla rychle ubývá chromozómů jednoho z partnerů, zvláště pokud byly genomy málo příbuzné (mezirodové fúze). V důsledku somatického crossing-overu může dojít k rekombinaci genů obou genomů. Předpokládá se, že tato somatická hybridizace se mohla uplatnit i v evoluci genetické informace.
Somatická hybridizace se využívá při přípravě hybridomů pro výrobu monoklonálních protilátek, ale i při mapování lidských chromozómů. Např. se nechá fúzovat lidská buňka s myší, která je defektní mutantou. Pokud dojde k rekombinaci, může lidský chromozóm tento defekt v myším genomu kompenzovat. Jestliže fúzující buňky budeme pěstovat na selekčním médiu, budou se postupně z myších genomů eliminovat lidské chromozómy s výjimkou toho, který kompenzuje myší defekt. Tímto způsobem byly získány různé klony buněk nesoucích některé lidské geny na pozadí jiného genomu. Např. genový komplex kódující u člověka HLA systém byl takto lokalizován na 6. chromozomu. Fúze buněk a zejména fúze membránových váčků (tzv. liposomů) lze využít i v genovém inženýrství – slouží jako vektory pro přenos DNA.
Obalené měchýřky
Klatrinové měchýřky
Klatrin
- komplexní protein tvořený šesti polypeptidovými řetězci (3 těžké a 3 lehké)
- řetězce vytváří komplex zvaný - triskelion
- seskupením šesti nebo pěti vznikají podjednotky, ze kterých vzniká souvislý klatrinový měchýřek
- adaptiny (protein): zprostředkuje vazbu klatrinového měchýřku na membránu
jsou pro některé receptory specifické → do určitého měchýřku se dostane
jen jediný typ ligandu
- klatrinový výběžek se odštěpí od membrány → rozpad klatrinového měchýřku - vyžaduje
dodání energie hydrolýzou ATP (vznik autoorganizační proces)
- jak se dostat do specifické cílové membrány?
- protein v-SNAR na měchýřku + komplement t-SNAR na cílové membráně („adresy“)
- správné spojení (doručení na adresu) je závislé na Rab proteinech (= monomerní GTPázy)
- poté následuje splynutí měchýřku s membránou
- klatrinem obalené měchýřky se podílejí na vysoce specifickém transportu měchýřků při regulované endocytóze, exocytóze
Koatomerové měchýřky
- uskutečňují transport mezi drsným ER a GA, mezi jednotlivými cisternami GA a konstitutivní exocytózu
- jsou obaleny COP proteinem (obalový protein) - coat protein
- komplex 7 COP proteinů = koatomer
- na rozdíl od klatrinu vyžaduje tvorba tohoto pláště ATP a plášť se nerozpadá po vytvoření měchýřku, ale až po jeho dotyku s cílovou membránou
- rozpad COP pláště je závislý na aktivitě GTPáz
Klatrinové měchýřky
Klatrin
- komplexní protein tvořený šesti polypeptidovými řetězci (3 těžké a 3 lehké)
- řetězce vytváří komplex zvaný - triskelion
- seskupením šesti nebo pěti vznikají podjednotky, ze kterých vzniká souvislý klatrinový měchýřek
- adaptiny (protein): zprostředkuje vazbu klatrinového měchýřku na membránu
jsou pro některé receptory specifické → do určitého měchýřku se dostane
jen jediný typ ligandu
- klatrinový výběžek se odštěpí od membrány → rozpad klatrinového měchýřku - vyžaduje
dodání energie hydrolýzou ATP (vznik autoorganizační proces)
- jak se dostat do specifické cílové membrány?
- protein v-SNAR na měchýřku + komplement t-SNAR na cílové membráně („adresy“)
- správné spojení (doručení na adresu) je závislé na Rab proteinech (= monomerní GTPázy)
- poté následuje splynutí měchýřku s membránou
- klatrinem obalené měchýřky se podílejí na vysoce specifickém transportu měchýřků při regulované endocytóze, exocytóze
Koatomerové měchýřky
- uskutečňují transport mezi drsným ER a GA, mezi jednotlivými cisternami GA a konstitutivní exocytózu
- jsou obaleny COP proteinem (obalový protein) - coat protein
- komplex 7 COP proteinů = koatomer
- na rozdíl od klatrinu vyžaduje tvorba tohoto pláště ATP a plášť se nerozpadá po vytvoření měchýřku, ale až po jeho dotyku s cílovou membránou
- rozpad COP pláště je závislý na aktivitě GTPáz
Žádné komentáře:
Okomentovat