69.1

69. DNA diagnostika

            Základní principy genového inženýrství se mohou využívat v diagnostice mnoha chorob, a to nejen genetických. Na základě specifické struktury DNA je možné diagnostikovat také různá infekční agens. Využívá se např. při identifikaci obtížně kultivovatelných mikroorganismů a virů. Komerčně dostupné jsou soupravy pro stanovení mykoplazmat, viru hepatitidy B, viru HIV a dalších. V případě HIV infikovaných jedinců je identifikace patogenů tímto způsobem možná ještě před objevením se protilátek v séru. Pomocí genového inženýrství by v budoucnu mělo být možné přímo najít poškozen geny a tím teoreticky diagnostikovat všechny geneticky podmíněné choroby, a to jak prenatálně, tak postnatálně. Pomocí DNA diagnostiky bude možné určit i geneticky podmíněnou individuální náchylnost ke kardiovaskulárním nebo autoimunním nemocem. Je možné využít toho, že mutace ovlivní štěpitelnost DNA pomocí restrikčních nukleáz, a tím dochází ke změnám v restrikčních mapách. Takovýto postup byl vypracován u srpkovité anémie. Největší budoucnost je možné očekávat od využití metody hybridizace nukleových kyselin. Stanovení detekuje přítomnost nebo nepřítomnost specifických nukleových kyselin, resp. specifických sekvencí bází, a umožňuje kvantifikaci. Když je třeba další informace o DNA, je nutné provést southern blotting. To vyžaduje štěpení originální DNA pomocí restrikčních enzymů a další separace fragmentů pomocí gelové elektroforézy. Jiný typ testů, který demonstruje, kde je nukleová kyselina lokalizována v buňce nebo ve tkáni, se nazývá hybridizace in situ. Tento postup se provádí na vzorcích získaných z biopsií nebo cytologických odběrů. Takto je možné např. lokalizovat virové částice v určitých buňkách nebo tkáních, popř. najít onkogenní sekvence nebo dokonce informační RNA v nádorech. Hybridizace in situ umožňuje zjistit i chromozomové translokace, které jsou podkladem některých genetických chorob.

        Přímá diagnostika – umožňuje zachytit a identifikovat mutaci zodpovědnou za onemocnění u postižených a ve sledované rodině. Podmínkou je znalost lokalizace genu a znalost jeho standardní sekvence. Metody přímé diagnostiky pracují buď s oligonukleotidovými sondami nebo využívají metod sekvenování zkoumaného genu. Nabízejí možnost odhalení heterozygotního přenašeče mutované alely i u jedince, v jehož příbuzenstvu postižený jedinec není znám.

Analýzy heteroduplexů – metoda přímé molekulárně genetické diagnostiky. Analyzovaný vzorek se smísí s referenční DNA, denaturuje se a pak se nechá opět hybridizovat. Pokud se sekvence referenční DNA liší od vzorku (například kvůli přítomnosti mutace), vzniknou kromě původních homoduplexů i smíšené molekuly tvořené jedním řetězcem ze vzorku a jedním z referenční DNA. Protože takové heteroduplexy obsahují nekomplementární úsek bez vodíkových můstků, budou se při elektroforéze na denaturačním gelu rozpadat podstatně dříve.

SSCP (single strand conformation polymorphism analysis) – jejím principem je elektroforéza jednovláknové DNA na nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě. Řetězec DNA se „sbalí“ podle vnitřních komplementarit, čímž vznikne prostorová struktura podobná např. tRNA. Rychlost, jakou pak jednořetězcová DNA putuje během elektroforézy nukleových kyselin, závisí na přesné konformaci. Protože i velmi malá změna v sekvenci nukleotidů může způsobit, že DNA vytvoří úplně jinou prostorovou strukturu, je možné pomocí SSCP odlišit často i záměnu jediné báze.

DGGE (denaturing gradient gen electrophoresis) – využívá se toho, že rychlost denaturace DNA závisí na počtu vodíkových můstků. Řetězce DNA se od sebe budou snáze oddělovat v místech bohatých na AT páry (CG páry jsou stabilnější). Používá se polyakrylamidový gel s postupně se zvyšující koncentrací denaturujících látek.

TGGE (temperature gradient gel electrophoresis) – namísto gelu s postupně se zvyšující koncentrací denaturujících látek se při ní používá postupně se zvyšující teploty gelu.

Chemické nebo enzymatické štěpení heteroduplexů – technika mismatch cleavage. Štěpení jednovláknového místa – tam, kde není úplná komplementarita obou vláken. Elektroforesa v denaturovaném gelu – průkaz přítomnosti štěpených nebo neštěpených fragmentů testované DNA.

PTT (protein truncation test) – metoda specifická pro detekci mutací, které mají za následek vznik předčasného terminačního kodonu a tím zkrácení proteinového produktu. Izolovaná mRNA – reversní transkripce – PCR – cDNA – transkripce a translace in vitro – velikost proteinového produktu testována elektroforeticky a srovnána s délkou standardního produktu.

Mutačně-specifická analýza RFLP – v případě, kdy mutace vytváří nebo ruší místo pro určitý restrikční enzym. PCR – amplifikace úseku DNA s restrikčním místem – restrikce specifickými restrikčními enzymy – gelová elektroforéza.

ASO (alelově specifické oligonukleotidy) – syntetizovány k detekci bodové nukleotidové diference v sekvenci DNA.

Diagnostika expanze trinukleotidů – amplifikace (PCR) oblasti genu s obsahem repetic (CAG)n – elektroforéza v polyakrylamidovém gelu – počet repetic souvisí s rozvojem onemocnění. Huntingtonova chorea.

            Nepřímá diagnostika

Metoda rodokmenová – musíme vyšetřit základní rodinu; metoda se opírá o vysoký stupeň RFLP v populaci. Je známý lokalizace genu, ale není známá přesně nukleotidová sekvence, nebo dosud nejsou charakterizovány jeho mutace zodpovědné za vznik onemocnění.

Mikrosatelity (SSRs – single sequence repeats) – rozlišit chromosomy rodičů, z nichž jeden může přenášet mutovaný gen (najít polyorfismus, který je ve vazbě se sledovaným genem, a pro který je rodič heterozygot). Zjistit, která z alel markeru segreguje s mutovanou alelou. Pomocí markerů zjistit, který chromosom byl přenesen na probanda (lze-li jednoznačně na základě vyšetřování stanovit, který fragment zdědil postižený jedinec, od kterého rodiče = rodina informativní. U neinformativní rodiny je nutné použít jinou restrikční endonukleasu).