68.1

68. sekvenování DNA – klasické metody a metody nové generace

Znalost pořadí bází určitého genu je naprosto nezbytným předpokladem pro inteligentní analýzu a další manipulaci s geny. Je to tedy zcela běžná součást jakékoliv práce v genovém inženýrství. Problém spočívá v tom, že molekula DNA je velmi dlouhá, obsahuje milióny bází, a to značně komplikuje analýzu, která by jinak po stránce chemické byla lehce řešitelná. Tato zdlouhavá analýza je finančně i časově značně náročná. Původně existovala pouze jediná možnost, jak určit pořadí bází v jednotlivých fragmentech DNA, a to nepřímo, pomocí pracné analýzy odpovídající RNA. 1975 objevena enzymatická metoda (Sanger a Coulson), 1977 chemická (Maxam a Gilbert). Základním principem obou metod je možnost oddělit od sebe různě dlouhé fragmenty DNA za použití elektroforézy na polyakrylamidových nebo agarózových gelech. Druhým nezbytným předpokladem je rozdělit statisíce bází dlouhou molekulu DNA na přesně definované úseky, které by bylo možno postupně sekvenovat. Nejdelší fragmenty DNA, které je možno ještě dobře sekvenovat najednou, jsou úseky dlouhé 500-1000 bází. Třetím důležitým krokem je nutnost vybrat ze směsi fragmentů, které vzniknou, jenom ty, jež nás z určitého hlediska zajímají. Značení pomocí radioaktivních izotopů P³² nebo pomocí fluorescenčních barviv. Gelový elektroforeogram je vzhledem ke svému gelovém charakteru možno skladovat jen velmi omezenou dobu při 4 °C. Proto se všude tam, kde je to možné využívá tzv. blottingu, tj. přenesení DNA na nitrocelulózový papír.

Enzymatický metoda – tato metoda je založena na syntéze DNA podle daného templátu, u kterého chceme znát pořadí bází. Na začátku se nejprve označí vznikající nová molekula DNA radioaktivním P³². Při syntéze DNA se kromě běžných nukleotidů použijí i nukleotidy, které nemají na cukerném zbytku v 3´pozici hydroxylovou skupinu (dideoxyribonukleotid). To znamená, že při začlenění takto defektní báze není možné další prodlužování řetězce DNA a syntéza se automaticky ukončí. Proto se tato metoda někdy nazývá „metoda založená na ukončování řetězce“. Syntéza DNA podle daného templátu se provede ve čtyřech paralelních stanoveních, pokaždé se použije jiný typ defektní báze. Získáme tak čtyři sady různě dlouhých fragmentů DNA. Fragmenty se potom seřadí pomocí elektroforézy podle délky řetězce. Pomocí autoradiografie se detekují pouze fragmenty, obsahující začátek molekuly DNA.

Chemická metoda – princip této metody spočívá v tom, že pomocí specifických chemických reakcí je dosaženo štěpení molekul DNA vždy pouze v místě určité báze. Nejprve však jsou molekuly DNA, u nichž chceme určit pořadí bází, označeny na 5´konci radioaktivním fosforem P³². takto označené molekuly DNA jsou rozděleny do čtyř vzorků a každý vzorek je jinak chemicky ovlivněn. Reakční podmínky jsou řízeny tak, že v průměru vzniká poškození řetězce DNA pouze v jednom místě. Ostatní nukleotidy stejného typu nejsou v řetězci ovlivněny. Na základě pravděpodobnosti dostaneme sérii různě dlouhých fragmentů původní molekuly DNA, přičemž pouze část z nich obsahuje začátek a je tedy radioaktivní. Fragmenty jsou elektroforeticky separovány v gelu na základě jejich délky a pomocí autoradiografie je možné vyhledat pouze ty, které jsou radioaktivní. Když tímto způsobem analyzujeme jeden vzorek pomocí látek štěpících DNA v mstě adeninu, druhý vzorek pomocí látek štěpících DNA v místě guaninu, třetí v místě cytosinu a poslední čtvrtý vzorek v místě cytosinu a thyminu, získáme autoradiogram, ze kterého je možné přímo určit pořadí bází v testované molekule DNA.

Automatická – fluorochromy, elektroforéza a detekce počítačem. Firma Dupont – fluorochromy přímo označila příslušné stopovací dideoxyprekurzory. 1 zkumavka, kapilární elektroforéza. Až 30 000 bází.

Masivní paralelní sekvenování – Obrovskou změnu v přístupu k sekvenování DNA znamenal příchod sekvenování nové generace (next-generation sequencing, zkráceně next-gen). Metody založené na různých principech umožňují masivní paralelní sekvenování obrovského množství molekul DNA ve velmi krátkém čase a s vysokou citlivostí. To s sebou pochopitelně přineslo i stinné stránky. Obrovské množství získaných dat je nejen velmi náročné na datový úložný prostor, ale i na samotné zpracování a následné vyhodnocení obsluhou. Bez zkušených bioinformatiků je tak přístup k těmto datům často velmi obtížný. Všechny přístupy navíc balancují mezi třemi základními požadavky na ideální sekvenaci. Ta by měla být schopná číst dostatečně dlouhé úseky DNA v jedné reakci, sekvenovat s dostatečnou přesností a sekvenovat bez nutnosti namnožení DNA před samotnou sekvenací, aby se eliminovalo vnášení chyby při amplifikaci DNA pomocí PCR (polymeráza s určitou, byť nízkou, pravděpodobností může včlenit chybný nukteotid). Čtení dlouhých úseků DNA umožňuje jednodušší skládání získaných sekvencí do původní, mnohem delší DNA. Dlouhou DNA je totiž zapotřebí nejprve fragmentovat, fragmenty osekvenovat a následně získané sekvence opět poskládat zpět. A čím delší získané sekvence jsou, tím je to díky dostatečně dlouhým unikátním překryvům snazší. Druhý požadavek snižuje chybovost sekvenační reakce, což zvyšuje možnou výtěžnost a citlivost detekce mutací získaných ze sekvenační reakce. Žádný z dostupných přístupů však v současné době všechny tyto parametry nesplňuje. V současné době se v praxi vyskytují sekvenátory, tzv. druhé generace, které pro sekvenaci vyžadují amplifikaci pomocí PCR. Její eliminaci přinášejíaž sekvenátory 3. generace, které umožňují sekvenaci jediné molekuly DNA. Jejich rozšíření je však stále nízké a chybovost vysoká.

                       Sekvenování 2. generace

Illumina – Světově nejrozšířenějším sekvenátorem 2. generace jsou přístroje Illumina, jejichž princip je založený na reverzibilní terminaci amplifikace DNA. Před samotnou sekvenací je templátová DNA opatřena adaptory, díky kterým se hybridizuje na sklíčko s imobilizovanými primery. V průběhu amplifikace díky tvorbě tzv. můstků zůstávají kopie DNA při sobě a vytvářejí klastry. V průběhu vlastní sekvenace jsou v každém kroku přidány směsi všech 4 nukleotidů, z nichž je každý značený jinou fluorescenční značkou se skupinou blokující další amplifikaci. Po inkorporaci správného nukleotidu se ostatní odmyjí a laserem odštěpená fluorescenční značka (tzn. nukleotid) je detekována jako signál odpovídající barvy a začíná další cyklus detekce následujícího nukleotidu. Systém Illumina disponuje vysokou kapacitou a velmi nízkou cenou za osekvenovanou bazi. Velká část přípravy sekvenačních reakcí je automatická a systém netrpí na rozdíl od technologie 454 problémy se sekvenací homopolymerních sekvencí. Původní problém s kratší délkou čtení se již podařilo vyřešit a nejnovější systémy umožňují číst sekvence dlouhé až 600  párů bazí.

454 (Roche) - Technologie 454 využívá principu sekvenování založeného na chemiluminiscenční detekci pyrofosfátu uvolněného pří začlenění nukleotidu do nově vznikajícího řetězce DNA (tzv. pyrosekvenování).

Sekvenování na polovodičovém čipu (Ion Torrent/Ion Proton) - Systémy Ion Torrent a Ion Proton (liší se kapacitou) jsou svým principem velmi podobné technologii 454 a liší se hlavně způsobem detekce inkorporace nukleotidu, resp. nukleotidů v průběhu sekvenační reakce. Systém také používá imobilizaci DNA na kuličkách (byť výrazně menších než 454) a emulzní PCR, ale detekce neprobíhá světlem, nýbrž měřením změn pH v jamkách. Při inkorporaci nukleotidu totiž dochází k uvolnění protonu. Intenzita změny snímaná velmi citlivým polovodičovým čipem odpovídá opět počtu inkorporovaných nukleotidů v daném kroku. Délka čtení je zhruba poloviční ve srovnání s technologií 454, ale menší kuličky umožňují vyšší kapacitu přístroje, a navíc odpadá potřeba složitého optického systému nezbytného pro analýzu při pyrosekvenování. Problém se sekvenováním homopolymerních sekvencí je i u této technologie.

SOLiD - Sekvenování Ligací oligonukleotidů a detekcí (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection, SOLid) je technologie založená na jiném principu, než ty předešlé. Templátová DNA je opět amplifikována na kuličkách (tentokráte magnetických) pomocí emulzní PCR. Kuličky obohacené o takto vzniklou klonální DNA jsou naneseny a navázány na sklíčko. Na adaptor pak hybridizují primery, které umožní navázání komplementární sondy, která rozpoznává 2 baze hned za primerem. Po ligaci sondy k primeru a odštěpení jejího 3’-konce dojde k uvolnění fluoroforu a detekci fluorescenčního záření. Sondy s různými kombinacemi bazí jsou označené čtyřmi různými fluorofory. Po sérii ligačních cyklů je nově vzniklý řetězec odstraněn a template je znovu osekvenován, tentokrát s primerem posunutým o jednu bazi. Po 5 sekvenacích je tak každá baze sekvenována dvakrát, což zvyšuje přesnost čtení.

Sekvenování 3. generace -  řada chyb v sekvenování 2. generace je způsobena amplifikací analyzované DNA před samotnou sekvenací. Tento problém by mělo odstranit sekvenování 3. generace, které umožňuje sekvenovat jednotlivé molekuly DNA. K odečtu takto slabých signálů je však zapotřebí velmi citlivých systémů, jejichž přesnost není dosud v řadě případů dostatečně vysoká.

Detekce pomocí nanopórů – Tato metoda je založená na různé změně elektrického proudu v póru pří průchodu různých bazí DNA. Změna proudu v čase je následně analyzována a převedena zpět do sekvence DNA. Metoda má však řadu úskalí, neboť DNA prochází nanopórem velmi rychle, což je možné vyřešit např. pomocí molekulárních motorů. Problémem je i skutečnost, že se do póru dostává v jeden okamžik úsek DNA s několika bazemi, které spolu interferují. To lze vyřešit využitím exonukleáz, které vždy odštěpí poslední nukleotid, který je identifikován samostatně při průchodu nanopórem, což ovšem vede k destrukci DNA.

Sekvenování jedné molekuly v reálném čase – tato technologie využívá fluorescenčních barviv navázaných na jednotlivé nukleotidy, které jsou díky velmi citlivé detekci detekovány v reálném čase syntézy komplementárního vlákna DNA (viz. Obr. 3.9). Zacílení světla na okolí polymerázy je dosaženo pomocí speciálních světlovodů, tzv. zero mode waveguides, které díky svým rozměrům navedou světlo do velmi malé oblasti v okolí polymerázy.

Heliscope – Tato technologie je založena na podobném principu, jako systém sekvenování 2. generace Illumina. Využívá totiž fluorescenčně značené reverzibilní terminátory extenze DNA. Při amplifikaci je zařazen na základě komplementarity se sekvenovanou DNA vždy pouze jediný nukleotid (pokud je komplementární s následující bazí v sekvenované molekule), který díky chemické modifikaci zabrání dalšímu prodlužování vznikajícího řetězce. Po odmytí ostatních nukleotidů je pomocí fluorescence zjištěno, o jaký nukleotid se jednalo, terminátor je odštěpen a celý proces je možné zopakovat.