68. Sekvenování DNA – klasické metody a metody nové generace

68. Sekvenování DNA – klasické metody a metody nové generace

·      Restrikční fragmenty DNA – obsahují části genů nebo celé geny – možnost namnožení klonováním, PCR à zisk homogenního vzorku DNA – dá se použít k zisku přesného pořadí nukleotidů

·      Dvě techniky

o   Chemické štěpení DNA – Maxam-Gilbert

o   Enzymatická, dideoxy metoda – Sangerova

Sangerova metoda

·      Syntéza fragmentů DNA, komplementárních k sekvenované DNA

·      Polymeráza I – vytvoří kopii sekvenované jednovláknové DNA

·      Reakční směs – jednovláknová DNA, směs všech 4 dideoxyribonukleotidů, DNA polymeráza, primer (oligonukleotid nastartuje polymeraci DNA)

·      Použití malého množství dideoxyribonukleotidů vzniká řada náhodně dlouhých komplementárních řetězců – každý ukončen dideoxyanalogem – kvůli aabsenci OH skupiny se syntéza zastaví

·      Reakce s dideoxyanalogy všech bazí v oddělených zkumavkách à výsledné směsi na gel, elektroforeticky rozděleny podle délky

·      Pro usnadnění detekce fragmentů – syntéza DNA ze značených nukleotidů – radioaktivně/fluorescenčně

·      Sloupce proužků – různě dlouhé oligonukleotidy končící zabudovaným typem analoga (A, T, C, G)

·      Pořadí bazí odečteno dle polohy proužků

·      Sekvence nukleotidů se odečte přímo z gelu

Maxam- Gilbertova metoda

·      Využívá chemického štěpení jednotlivých typů bazí

·      Práce s jednovlánovou DNA, na jednom konci radioaktivně značena

·      Reakce probíhá ve čtyřek zkumavkách, v každé zkumavce prováděno štěpení jen určitých typů bazí

·      DNA se štěpí jen v místě určitých bazí à vzniká směs různě dlouhých fragmentů – končí v místě určité báze

·      Elektroforézou v hustém polyakrylamidovém gelu určíme rozdíl v délce fragmetů, a vzdálenost poslední báze od začátku fragmentu à sekvence úseku