67.1

67. editace genomu (genový knock-out, knock-in, knock-down)

            Typ genového inženýrství, ve kterém je DNA vkládána, deletována, modifikována nebo nahrazována v genomu živých organismů. Obvyklými metodami je použití zkonstruované nukleázy, např. tzv. „molekulární nůžky“. Tyto nukleázy vytvářejí specifické zlomy v obou řetězcích v požadovaném místě v genomu. Tyto jsou opraveny homologní rekombinací nebo spojováním nehomologních konců, což vede k mutacím. Zkonstruované nukleázy: meganukleázy, nukleázy zinkových prstů, TALEN (transcription activator-like effector-based nucleases), CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats).

            Meganukleázy – schopné rozpoznat a rozdělit velké sekvence DNA. Mají dlouhé rozpoznávací sekvence. Velmi specifické na sekvence, proto vytvořeny specificky na určité sekvence. Méně toxické v buňkách kvůli specifičnosti. Drahé na vytvoření.

            Nukleázy zinkových prstů – nespecifický DNA enzym spojený se specifickým proteinem, který rozpozná určité sekvence (zinkové prsty). Kontrola exprese specifického genu. Obsahují DNA štěpnou doménu.

            TALEN (transcription activator-like effector-based nuclease) – spojení specifické DNA-vazebné domény a nespecifické DNA-štěpné domény. Rozpoznávají určitý nukleotid.

            CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) – adaptivní imunita bakterií. Obsahují krátké virové sekvence, které byly pohlceny bakterií. Cas (CRISPR associated proteins) zpracují tyto sekvence a stříhají odpovídající virové DNA sekvence (možnost sestřihu genomu kdekoliv).

            Aplikace – cílená genová mutace, genová terapie, tvorba chromosomální rekombinace, studie funkce genu s kmenovou buňkou, transgenní zvířata.

Národní akademie pro vědu, inženýrství a medicínu ve spojených státech dospěla k závěru: že by vědcům mělo být umožněno využívat editací genomu v lidských embryích pro výzkumné účely. A také by nakonec mohlo být přijatelné využít tuto technologii pro modifikaci embryí určených pro implantaci, pokud by cílem měla být léčba závažné choroby a k dispozici by nebyly jiné rozumné alternativy.

Lu You na Sichuanské Universitě v Chengdu – klinická studie – bezpečnost PD-1 knockoutu u T buněk při léčbě metastatického malobuněčného karcinomu plic. USA počátek roku 2017, Čína – březen 2017 karcinom močového měchýře, prostaty a ledvin.

            Knock-out – technika, ve které jeden z genů je vypnut nebo nahrazen neaktivním. Přírodně k němu dochází třeba mutací. Používá se to k zjištění funkce nějakého genu.

Řízený – úprava plazmidu nebo jiné DNA struktury, které je pak dodána do kmenové buňky. struktura se rekombinuje s cílovým genem. Přerušení genu a translace nefunkčního proteinu.

Podmíněný – krátké LoxP sekvence obalí určitý gen, ty jsou rozpoznány Cre-rekombinázou, což je virový enzym, který ty sekvence dokáže rozpoznat, rekombinuje je a deletuje gen jimi obalený.

            Knock-in – substituce nebo inserce genu. Inserce do specifického lokusu (cílená). Tvorba modelů nemoci. Vede k interakcím mezi insertovaným genem a ostatním genomem a tvoří se nevysvětlitelné fenotypy.

            Knock-down – snížená exprese jednoho nebo více genů. Přes genetické modifikace nebo léčbu činidly jako krátké DNA nebo RNA oligonukleotidy, které mají komplementární sekvence ke genu nebo mRNA transkriptu. dsRNA (double-stranded) či shRNA (short hairpin) dodána do buněk, zpracování na siRNA (small interfering). RISC (RNA-induced silencing complex) rozpozná siRNA, která je komplementární k cílové mRNA, a štěpí ji ribovukleázami, léčebné činidlo. miRNA – blokace mRNA translace, pre-mRNA spojovacích míst nebo štěpných míst pro nukleázy, částečně komplementární k mRNA, typicky cílený na 3´nepřekládaný úsek, více mRNA, cíl léků, léčebné činidlo, diagnostický nástroj a biomarker.