67. Editace genomu (genový knock-out, knock-in a knock-down)

67. Editace genomu (genový knock-out, knock-in a knock-down)

Knock-in

·      Metoda genetického inženýrství

·      Zahrnuje substituci DNA (one-for-one) v lokusu nebo vložení nové sekvence

·      Nejčastěji se provádí na myši – velká podoba lidskému genomu

·      Rozdíl mezi knock-in a normální genovou translokací je, že při knock-in je gen vložen do specifického lokusu a tím pádem se jedná o cílenou inserci

·      Využití: vytváření modelů nemocí, jedná se techniku, která studuje funkci jednotlivých regulačních mechanismů, které řídí přirozenou funkci genu

·      Funkci sledujeme pozorováním nového fenotypu organismu

·      Vznikl jako modifikace původní knock-out techniky

·      Použití IoxP – ohraničí oblast která bude excitována při expresi Cre rekombinázou

·      Buňky embrya s touto požadovanou modifikací jsou implantovány do blastocysty, která se vyvine do dospělé chimerické myši – některé buňky mají informaci původní, některé modifikovanou, požadovaný upravený gen se přenese na následné potomstvo

·      Knock-in umožnil poprvé hypotézou řízené studie o genových modifikací a výsledné fenotypy

o   Mutace genu p53 – příklad vystavení benzo(a)pyrenu, mutovaná kopie se vloží dogenomu myší – zde plicní tumory pozorované u myší s knock-in podporují hypotézu o karcinogenitě látky

o   Novější techniky umožňují vložení genu pro zelený fluorescenční protein prasatům (systémem CRISPR/Cas9), který umožňuje mnohem přesnější a úspěšnější genovou inserci

o   Rychlost CRISPR/Cas9 zprostředkovaného knock-in umožňuje bialelární modifikace některých genů a pozorování fenotypu v jedné generaci

Knock-out

·      Rozdílem je, že zde se zaměřuje na deleci části DNA nebo na vložení irelevantní DNA sekvence pro narušení genové exprese určitého lokusu

·      Knock-in může být chápán jako zisk nové mutační funkce, oproti tomu knock-out jako ztráta funkce mutace

·      Díky úspěchu knock-in lze v budoucnosti očekávat mnoho klinických aplikací – například úseky lidského imunoglobulinového genu aplikovaného myši mohou být terapeuticky užitečné

·      Problém – Knock-in aplikace vede ke zvýšení komplexnosti, složitosti reakcí a proto mohou vést k více vedlejším účinkům a těžce vysvětlitelným fenotypům, dále také rozdílnost genomu myši a člověka

Knock-down

·      Experimentální technika, kterou se snižuje exprese genu organismu, toho se dosáhne genetickou modifikací nebo reakcí s krátkým DNA nebo RNA oligonukleotidem, který má sekvenci komplementární buď k nějakému genu nebo mRNA transkriptu

·      Po provedení modifikace vzniká knock-down organismus

·      Pokud je změna způsobena expresí skrz oligonukleotid vázaný na mRNA nebo dočasně vázaný na gen, je tato změna pouze přechodná a nemění chromozomální DNA – přechodný knock-down

·      Snížená exprese může být způsobena blokováním transkripce, degradací mRNA transkriptu, blokováním mRNA translace, blokováním sekvence pro zahájení translace nebo místa pro štěpení endonukleázou

·      Využití – studování genu který byl sekvenován, ale má neznámou funkci – takový postup se nazývá „reverzní genetika“