66. transgenní organismy
Transgenní organismy jsou živočichové, jejichž genom byl
uměle rozšířen o jeden nebo několik funkčních genů, přičemž celý nový genom je
dále předáván potomstvu. Předpokládá to vnesení genů do zárodečné linie, tj. do
buněk, ze kterých vznikají pohlavní buňky. tato metoda je jedním
z nejdůležitějších objevů v biologii posledních let. Transgenní
organismy jsou nástrojem, který může přinést nové světlo do vývojových
regulací, do působení onkogenů, do jemných interakcí buněk v rámci
imunitního systému atd. kromě toho technologie transgenních organismů umožňuje
vytvoření přesných zvířecích modelů pro lidské geneticky podmíněné choroby.
Také je možné produkovat ve velkém množství a ekonomicky výhodně důležité
proteiny pomocí geneticky ovlivněných hospodářských zvířat. První živočich,
který měl experimentálně zavedený cizí gen, byl získán mikroinjekcí viru SV40
do blastocysty myši. Přítomnost injikované DNA ve velkém počtu somatických
buněk u této myši demonstrovala, že integrace virové DNA do zárodečné linie je
možná. Specifickým problémem při tvorbě transgenních organismů je přenos genů
do živočichů.
Přímé mikroinjekce
do jádra oplodněných vajíček – mikroinjekce klonované DNA přímo do
prosnukleu oplodněných vajíček je nejvíce používanou a nejúspěšnější metodou
pro tvorbu transgenních myší. Většinou je mnoho kopií DNA uspořádáno stabilně
do hostitelského genomu. Předpokládá se, že injikované molekuly DNA se spojují
s homologními místy a ve většině případů se inserují na jedno místo
chromozomu. Náhodné chromozomové zlomy, způsobené reparačními enzymy, mohou
sloužit jako integrační místa pro vazbu cizí DNA. Často se však vyskytují
delece, duplikace, translokace hostitelských sekvencí. Injikovaná DNA nemusí
být vždy integrována do hostitelského genomu. Někdy je uchována jako stabilní
struktura, podobná epizomu (element vyskytující se v buňce buď jako
nezávisle se replikující molekula v cytoplazmě, nebo jako součást
hostitelského chromozomu buňky). Byla již také popsána epizomální replikace a
přenos na potomstvo. Hlavní výhodou přímých mikroinjekcí pro tvorbu
transgenních organismů je to, že je metoda velmi účinná. Nicméně má také
nevýhodu a tou je, že nemůže být použita pro přenos DNA do buněk pozdějších
vývojových stádií.
Injekce retroviry
– na rozdíl od přímých mikroinjekcí, retroviry se integrují přesně známým
mechanismem na přesně definovaná místa v genomu. Pouze jedna kopie
provirové DNA je začleněna na daném chromozomálním místě a nevyskytují se žádné
přesuny v hostitelském genomu. Expozici virům je možné provádět v předimplantačním
stadiu nebo mohou být exponovány buňky pěstované in vitro. Existují také
metody, při kterých se virus přenáší i v postimplantačním období. Přitom
dochází k transfekci mnoha somatických buněk. Hlavní výhodou při přenosu
DNA pomocí retroviru je to, že je metoda technicky velmi jednoduchá že mohou
být injikovány buňky v různých stádiích vývoje. Tato výhoda se uplatní
zejména při identifikaci hostitelských genů, které jsou narušeny insercí cizí
DNA. Hlavní nevýhodou používání retrovirů pro přenos genů je omezení velikosti
DNA, kterou mohou přenášet. Existují také problémy s reprodukovatelností
exprese u živočichů.
Embryonální
zárodečné buňky – z embryonálních zárodečných buněk byla vytvořena
linie EC, která se zachovává diploidní karyotyp i v kultuře. Když jsou
tyto buňky injikovány do blastocysty hostitele, začínají kolonizovat embryo a
dostávají se mimo jiné i do buněk zárodečné linie, a tím do vznikajících
pohlavních buněk. Přenos genů do buněk linie EC je možné provést jakýmkoliv
běžným způsobem. Jednoduše mohou být selektovány a klonovány buňky s cizí
DNA. Takto vyselektované EC buňky se injikují do blastocysty. Vznikne tak
chiméra, která produkuje i pohlavní buňky, jež mají začleněn cizí gen. Pomocí
křížení a selekce je možné získat homozygotní organismy pro cizí gen
Každá ze tří metod pro tvorbu transgenních živočichů má
určité výhody a nevýhody. Injekce do pronukleu je metoda vhodná pro zajištění
exprese cizích genů téměř v jakékoliv tkáni. Retroviry nebo retrovirové
vektory je nejlepší použít, když je nutný přenos genu na určité místo
chromozomu. Nejnovější metoda pro tvorbu transgenních organismů, založená na EC
buňkách, dovoluje provádět jakékoliv změny v genetickém materiálu myší.
Exprese genů u
transgenních živočichů – hlavním problémem při konstrukci transgenních
organismů je předurčení tkáně, ve které má docházet ke specifické expresi
přenesených genů. Exprese přenesených genů je závislá na lokalizaci místa
v chromozomu, kde dojde k inzerci genu. Přítomnost prokaryotických
vektorů inhibuje správnou expresi. Pro tkáňově specifickou expresi jsou nutné
různé tkáňově specifické elementy umístěné v různé vzdálenosti od
strukturních genů. Tkáň, ve které je určitý gen exprimován, je určena kombinací
tkáňově specifického regulačního proteinu se specifickým promotorem.
V řadě případů by bylo velmi žádoucí mít možnost expresi přenesených genů
ovlivňovat pomocí externích stimulů. Promotory genů by mohly být modulovány
např. hormonálními nebo jinými stimuly. Geny introdukované do živočichů se náhodně
integrují na různá místa, i velmi vzdálená od dotyčného defektního genu. Proto
se mutovaný a introdukovaný gen mohou od sebe v průběhu dalších generací
separovat. Do budoucna je nutné zejména charakterizovat a izolovat
chromozomální regulační elementy, kontrolující vývoj a aktivaci genů na dlouhou
vzdálenost.
Aplikace
transgenní technologie – pro posledních několik let je charakteristické
zvýšení používání transgenních živočichů. Velkou perspektivu má tvorba
recesivních a dominantních mutací určitých genů a tvorba zvířecích modelů pro
studování modelů lidských dědičných chorob. Existuje rovněž možnost přenést
celý nový chromozom. Takovým organismům se říká „transsomické“. Využití
transgenních zvířat v zemědělství je ohromné. V poslední době se
používají transgenní organismy, které produkují danou látku v mléce.
Žádné komentáře:
Okomentovat