65.1

65. metody přenosu DNA do eukaryontních buněk, typy vektorů

Vektory

            Hlavním cílem genového inženýrství není pouhý přenos genů do buněk. Hlavním cílem je zajištění exprese přenesených genů. Proto je nutné přenášet fragment cizí DNA v rámci expresních vektorů, které zajistí expresi cizí DNA, a tím i produkci cizorodých látek. Expresní vektory se skládají z promotorů, vazebných míst pro navázání RNA polymerázy, terminátorů, genů pro selekční systém a genu, jehož přenesení je naším cílem.

            Nejdůležitější součástí vektoru je promotor, který je nutný pro zahájení transkripce, neboť aktivuje DNA-závislou RNA polymerázu. Cizorodá DNA je umístěna až za nějaký účinný bakteriální promotor. Jedním z nejčastěji užívaných silných promotorů je promotor pro beta-laktamát, který je součástí plazmidu pBR 322. Tento promotor ale ne vždy pracuje tak, jak potřebujeme. Někdy totiž může vysoká koncentrace cizorodého proteinu blokovat růst hostitelské bakterie. Proto jsou lepší takové promotory, které jsou účinné, ale přitom regulovatelné. Z nich nejznámější je promotor z Lambda-fága. Regulování exprese je dosaženo změnami teploty. Při teplotě 31 °C dochází k velmi silné expresi. Jiným často používaným promotorem je typ promotoru, který je udržován ve vypnutém stavu represorem, který je běžně přítomen v bakteriálních buňkách. Exprese je dosaženo přidáním induktoru.

            Kromě promotoru musí být součástí vektoru také specifická sekvence, která umožní navázání mRNA na ribozom a v určité vzdálenosti musí být také iniciační kodon ATG.

            Jako vektorů se nejčastěji užívá plazmidů. To jsou malé kruhové molekuly dvoušroubovicové DNA, které se u některých bakterií a kvasinek přirozeně vyskytují vedle hlavního chromozomu. V průběhu množení bakterií se množí i plazmidy jako nezávislé jednotky. Ačkoliv plazmidy tvoří jen zlomek celkové bakteriální DNA, jsou pro bakterie velmi důležité, neboť mnohdy nesou vitální geny, např.  geny pro rezistenci na antibiotika.

            V průběhu času se ukázalo, že v plazmidech je možné přenášet DNA jen do určité velikosti. Pro delší sekvence DNA je lepším vektorem Lambda-fág, pomocí kterého je možné přenášet fragmenty DNA až o délce 15 000 párů bází. Experimentálně byly vytvořeny speciálně upravené Lambda-fágy, které vyhovují podmínkám pro bezpečné experimenty.

            Nakonec se ukázalo, že ani Lambda-fág není dostatečně vhodný pro přenos celých genů vyšších živočichů, které mají 30-40 000 párů bází. V takových případech je nutné využít speciálních vektorů zvaných cosmidy, které vznikly z plazmidu pBR 322 a cos sekvencí některých virů.

            Z virových vektorů je nejznámější virus SV40. jeho DNA je tvořena uzavřeným kruhem s přibližně 5 200 páry bází. Pro replikaci viru v buňkách je nutná pouze sekvence zahajující replikaci, a tzv. T antigen. Když je jakákoliv i značně velká molekula DNA spojena s těmito sekvencemi, dochází k replikaci celé hybridní molekuly nezávisle na buněčné DNA.

Přenos DNA do buněk savců

            Při provádění genových manipulací u bakterií nečinil vlastní přenos DNA do buněk žádné potíže, neboť přenos plazmidů mezi bakteriemi je běžný i za normálních okolnosti. Aplikaci metod genového inženýrství na eukaryontní buňky živočišné a rostlinné bránilo zejména to, že dlouho nebyla známa efektivní metoda pro přenos DNA do buněk. Zvláště obtížný je přenos DNA do buněk savců. V průběhu posledních let bylo vypracováno několik metod, kterými je možné dosáhnout přenosu DNA do buněk savců. Jsou to metody založené na využití virů, chemických látek, fyzikálních faktorů, fúzí biomembrán anebo přímé mikroinjekce do buněk.

            Přenos DNA zprostředkovaný viry – pro přenos DNA do buněk savců je možné využít některé viry. Jako nejvhodnější se ukázaly retroviry, neboť u nich je dosaženo nejlepší exprese cizích genů. Výhodou je také to, že prakticky všechny buňky jsou infikovány. Přitom určitou nevýhodou je to, že samotná infekce retroviry má některé vedlejší účinky. Celá procedura trvá jen několik minut. Nejvíce se této metody využívá v genové terapii.

            Chemicky zprostředkovaný přenos DNA – běžně je využívána metoda s precipitací DNA pomocí fosforečnanu vápenatého. Molekuly DNA jsou po precipitaci s fosforečnanem vápenatým fagocytovány buňkou a část fagocytovaných molekul DNA je integrována do buněčné chromozomální DNA. Tato metoda má ale poměrně malou frekvenci vzniku stabilních transfektantů. Zvláště nízká účinnost je při použití lidských buněk, kde se pohybuje okolo 10^-6. v poslední době se objevilo několik modifikací této metody (DMSO, butyrát sodný), které zvyšují účinnost přenosu DNA.

            Fyzikálně podmíněný přenos DNA – přenos DNA do buněk je zvýšen také při aplikaci elektrického proudu na buňky – elektroporace. Krátkodobý puls o napětí řádově několika voltů naruší přechodně strukturu plazmatické membrány a umožní prostup molekul DNA.

            Metody založené na přenosu DNA pomocí fúzí biomembrán – tato skupina metod vychází primárně z fúzí celých buněk. V genovém inženýrství se jedná o fúze bakteriálních protoplastů se savčími buňkami. Spontánně fúze neprobíhají, proto je vždy třeba aplikovat fúzogen, který vyvolá fúzi membrán. Nejčastěji je jako fúzogen využíván polyetylém glykol, ale poměrně často se používá i Sendai virus a v poslední době i aplikace elektrického proudu. Pro účely genového inženýrství je výhodnější použít místo bakteriálních protoplastů uměle připravené váčky z biomembrán naplněné molekulami DNA. Jako přepravní váčky se používají membrány z erytrocytů nebo uměle připravené membrány – lipozómy. Tyto váčky jsou naplněny DNA a potom je provedena jejich fúze se savčí buňkou, opět za pomoci fúzogenů.

            Mikroinjekce – další možností, jak dostat nový gen do savčí buňky, je metoda přímých mikroinjekcí pomocí skleněných mikrokapilár o průměru 0,1 µm. je to technika velmi účinná, neboť více jak 50 % injikovaných buněk cizorodou DNA inkorporuje. Velice výhodné je, že mohou být injikovány libovolné buňky jakoukoliv DNA a není nutné používat selekční systémy. Nevýhodou je velká pracnost mikroinjekcí. I po jejich plném zvládnutí je možné za hodinu injikovat maximálně 100 buněk, což je pro většinu pokusů málo. V jediné oblasti jsou mikroinjekce nenahraditelné, a to při přenosu genů do oplodněných savčích vajíček.

Selekční systémy

            Pouze malá část buněk exponovaných cizorodou DNA tuto cizí DNA inkorporuje do svých chromozomů a funkčně ji integruje. Pro další rozvoj genového inženýrství bylo proto nutné vyvinou určité selekční metody, které by umožňovaly najít buňky s integrovanou cizí DNA na pozadí miliónů jiných buně, které cizí DNA nepřijaly. Všechny selekční systémy pracují na principu toho, že současně s cizí DNA je do buněk přenesena i DNA, která kóduje určitý fenotypický projev, který je možné selektovat. První takový selekční systém byl založen na genu pro thymidin kinázu. Ve speciálním selekčním médiu HAT s aminopterinem přežívaly pouze buňky, které měly funkční gen pro thymidin kinázu, z buněk bez ní pouze buňky, kterým byl tento gen dodán. Zmíněný přístup vyžadovat, aby buňky určené k přenosu DNA, byly bez thymidin kinázy. Takových buněčných linií je však známo pouze několik. Proto se hledaly jiné selekční systémy, které by bylo možné použít i u normálních buněk. Tyto dominantní selektovatelné markery vyvolávají u normálních buněk takovou změnu fenotypu, která může být selektována. Nejčastěji gpt-gen kódující xantin-guanin fosforibosyltransferázu a neo-gen kódující fosfotransferázu.

            Gpt selekce – gpt-gen umožňuje využívat bakterii jako zdroje purinových nukleotidů xantin. Odpovídající savčí enzym využívá jako substrát hypoxantin a xantin nemůže využít. Je-li kyselinou mykofenolovou blokována alternativní cesta syntézy purinových bází, normální savčí buňky hynou, i když je v médiu přítomen xantin. Pouze ty buňky, které inkorporovaly bakteriální gen, přežívají.

            Neo selekce – tento selekční systém je založen na bakteriálním genu pro rezistenci na neomycin. Zmíněný gen kóduje enzym, který fosforyluje, a tím inaktivuje neomycin, eukaryontní buňky jsou citlivé k působení derivátu neomycinu zvanému G418. Také tento derivát je inaktivován produktem neo-genu. Vektor s neo-genem může být využit k přeměně savčích buněk na buňky rezistentní vůči G418. v přítomnosti G418 rostou pouze buňky, které inkorporovaly bakteriální gen.

            Oba zmíněné selekční systémy pracují každý na zcela jiném principu, a tak mohou být používány i současně, např. při přenosu dvou různých genů na dvou různých vektorech. Existence těchto selektivních systémů teoreticky umožňuje přenést jakýkoliv gen do savčí buňky.