65. Metody přenosu DNA do eukaryontních buněk, typy
vektorů
- musíme zajistit nejen přenos genu do buňky, ale také
jeho expresi - nutnost expresivních vektorů – promotor, terminátor, geny pro
selekční systém a také samozřejmě samotný gen, o jehož přenesení nám jde
promotor – nejdůležitější – nutný pro zahájení transkripce – aktivuje DNA závislou RNA polymerázu (cizorodá DNA je umístěna až za promotor), (z nejčastěji užívaných silných obligatorních promotorů je promotor beta-laktamát, který je součástí plazmidu pBR 322)
- součástí vektoru také musí být specifická sekvence, která umožní navázání mRNA na ribozóm, a v určité vzdálenosti také iniciační kodon ATG
- jako vektorů se nejčastěji užívají plazmidy – malé kruhové molekuly dvoušroubovicové DNA (přirozeně se vyskytují u některých bakterií – nezávislé jednotky, nesou pouze zlomek celkové bakteriální DNA, ale mnohdy nesou vitální geny – rezistence na antibiotika,…)
plazmidů je možno využívat jen k přenesení DNA do určité velikosti, pro delší sekvence je možno využít: Lambda-fág (až 15kbp), cosmidy plazmidu pBR 322 (30 – 40kbp), virové vektory (virus SV40 – 5200bp) – pro replikaci viru nutná pouze sekvence zahajující replikaci
- přenos DNA do baktérie nečiní žádný problém X přenos DNA do buněk savců je daleko obtížnější: využití virů, chemických látek, fyzikálních faktorů, fúzí biomembrán a přímé mikroinjekce do buněk
viry – retroviry (začlení se pouze do dělících se buněk) a adenoviry (i do nedělících se), trvá jen pár minut, využití hlavně v genové terapii
chemické látky – precipitace DNA pomocí fosforečnanu vápenatého - DNA fagocytována buňkou, část se začlení do chromozomální DNA, malá frekvence vzniku stabilních transfektantů (u lidských buněk asi 10-6), některé látky zvyšují účinnost přenosu DNA do buňky (DMSO - dimethylsulfoxid, butyrát sodný)
fyzikálně podmíněný přenos – elektroporace (aplikace elektrického proudu na buňku) – krátkodobý puls o napětí několika voltů - přechodné narušení plazmatické membrány a umožnění prostupu molekul DNA; Gene Gun – mechanický přenos DNA vázané na kovové mikroprojektily do buněk pomocí tlaku plynů nebo mikroexploze (použití u rostlinných buněk a u buněk kůže)
přenos pomocí fúzí biomembrán – fúze celých buněk (pomocí fúzogenů - polyetylenglykolu, Sendai viru a aplikace elektrického proudu); fúze váčků z biomembrán (váčky z membrány erytrocytů nebo uměle připravené lipozómy – naplněny DNA, potom se indukuje jejich fúze s buňkou, opět pomocí fúzogenů)
mikroinjekce – skleněné mikrokapiláry o průměru 0,1μm, úspěšnost více než 50%, mohou být injikovány libovolné buňky libovolnou DNA, nevýhodou velká pracnost, za hodinu max 100 injikovaných buněk, nenahraditelné při přenosu genů do oplodněných savčích vajíček
transgenní organismy – přímé mikroinjekce do jádra oplodněných vajíček, retroviry, transfekce embryonálních zárodečných buněk, mikroinjekce do blastocysty (- produkce nových proteinů v mléce, živočišné modely lidských nemocí)
selekční systémy – pouze malá část buněk, které jsou vystaveny cizorodé DNA tuto DNA inkorporuje do svých chromozómů a funkčně ji integruje, takové buňky je třeba najít a odlišit od milionů buněk, které cizí DNA nepřijaly - současně s cílovou DNA se do buňky přenese i DNA kódující určitý fenotypický projev, na jehož základě je možno cílovou buňku odlišit (gen pro enzym umožňující rezistenci na neomycin, gen pro thymidin kinázu, gpt-gen umožňující využívat jako zdroje purinových nukleotidů xantin,…)
promotor – nejdůležitější – nutný pro zahájení transkripce – aktivuje DNA závislou RNA polymerázu (cizorodá DNA je umístěna až za promotor), (z nejčastěji užívaných silných obligatorních promotorů je promotor beta-laktamát, který je součástí plazmidu pBR 322)
- součástí vektoru také musí být specifická sekvence, která umožní navázání mRNA na ribozóm, a v určité vzdálenosti také iniciační kodon ATG
- jako vektorů se nejčastěji užívají plazmidy – malé kruhové molekuly dvoušroubovicové DNA (přirozeně se vyskytují u některých bakterií – nezávislé jednotky, nesou pouze zlomek celkové bakteriální DNA, ale mnohdy nesou vitální geny – rezistence na antibiotika,…)
plazmidů je možno využívat jen k přenesení DNA do určité velikosti, pro delší sekvence je možno využít: Lambda-fág (až 15kbp), cosmidy plazmidu pBR 322 (30 – 40kbp), virové vektory (virus SV40 – 5200bp) – pro replikaci viru nutná pouze sekvence zahajující replikaci
- přenos DNA do baktérie nečiní žádný problém X přenos DNA do buněk savců je daleko obtížnější: využití virů, chemických látek, fyzikálních faktorů, fúzí biomembrán a přímé mikroinjekce do buněk
viry – retroviry (začlení se pouze do dělících se buněk) a adenoviry (i do nedělících se), trvá jen pár minut, využití hlavně v genové terapii
chemické látky – precipitace DNA pomocí fosforečnanu vápenatého - DNA fagocytována buňkou, část se začlení do chromozomální DNA, malá frekvence vzniku stabilních transfektantů (u lidských buněk asi 10-6), některé látky zvyšují účinnost přenosu DNA do buňky (DMSO - dimethylsulfoxid, butyrát sodný)
fyzikálně podmíněný přenos – elektroporace (aplikace elektrického proudu na buňku) – krátkodobý puls o napětí několika voltů - přechodné narušení plazmatické membrány a umožnění prostupu molekul DNA; Gene Gun – mechanický přenos DNA vázané na kovové mikroprojektily do buněk pomocí tlaku plynů nebo mikroexploze (použití u rostlinných buněk a u buněk kůže)
přenos pomocí fúzí biomembrán – fúze celých buněk (pomocí fúzogenů - polyetylenglykolu, Sendai viru a aplikace elektrického proudu); fúze váčků z biomembrán (váčky z membrány erytrocytů nebo uměle připravené lipozómy – naplněny DNA, potom se indukuje jejich fúze s buňkou, opět pomocí fúzogenů)
mikroinjekce – skleněné mikrokapiláry o průměru 0,1μm, úspěšnost více než 50%, mohou být injikovány libovolné buňky libovolnou DNA, nevýhodou velká pracnost, za hodinu max 100 injikovaných buněk, nenahraditelné při přenosu genů do oplodněných savčích vajíček
transgenní organismy – přímé mikroinjekce do jádra oplodněných vajíček, retroviry, transfekce embryonálních zárodečných buněk, mikroinjekce do blastocysty (- produkce nových proteinů v mléce, živočišné modely lidských nemocí)
selekční systémy – pouze malá část buněk, které jsou vystaveny cizorodé DNA tuto DNA inkorporuje do svých chromozómů a funkčně ji integruje, takové buňky je třeba najít a odlišit od milionů buněk, které cizí DNA nepřijaly - současně s cílovou DNA se do buňky přenese i DNA kódující určitý fenotypický projev, na jehož základě je možno cílovou buňku odlišit (gen pro enzym umožňující rezistenci na neomycin, gen pro thymidin kinázu, gpt-gen umožňující využívat jako zdroje purinových nukleotidů xantin,…)
Vektory používané k přenosu DNA
Vektor – plazmid (malá kruhová
molekula dvoušroubovicové DNA schopná autonomní
replikace uvnitř bakterií),
bakteriofág nebo cosmid (vektor vzniklý spojením DNA plazmidu s cos sekvencí
některých virů), který je určen k přenosu cizí DNA a zajistí její expresi (a tím i
produkci cizorodých látek)
- viry jsou i přirozenými vektory při přenosu genů z jednoho druhu organismů na druhý
(onkoviry jsou vektory onkogenů zodpovědných za nádorovou transformaci buňky)
- i když plazmidy tvoří jen zlomek celkové bakteriální DNA, jsou pro ně důležité – často
nesou vitální geny , např. geny pro rezistenci na antibiotika
Vektory musí obsahovat:
- promotor – nutný pro zahájení transkripce, aktivuje DNA - závislou RNA polymerázu
- specifické sekvence – vazebná místa pro navázání RNA polymerázy (mRNA na ribosom)
- iniciační kodon ATG
- terminátor
- gen pro selekční systém, resp. marker
- gen jehož přenesení je našim cílem
Klonování genů - namnožení určitého úseku DNA pomocí klonovacího vektoru, který obsahuje
vložený úsek cizorodé DNA → vložen do organismu (např. do E. coli, kvasinky), tam
namnožení vektoru
- klasický vektor pro klonování v E. coli je plazmid pBR322 (obsahuje geny pro
rezistenci na ampicilin a tetracyklin) – jeho součástí je promotor pro beta-laktamát
Klon – populace DNA molekul vzniklých replikací jediné molekuly
5 kroků klonování:
1) inzerce cizorodé DNA do vektoru
- plazmidy nebo fágový genom jsou pro rekombinaci upravovány: odstranění nepotřebných
sekvencí a vložení genů (např. pro rezistenci na antibiotika)
- vektory obsahují dále rekogniční sekvence pro řadu restrikčních enzymů
- přítomnost restrikčních míst umožňují inzerci DNA fragmentů (rozštěpení plazmidu i cizorodé
DNA restriktázou → lepivé konce se pomocí DNA ligázy spojí kovalentní vazbou)
2) vnesení vektoru do hostitelských buněk
- transformací - přímý vstup DNA přes plazmatickou membránu a buněčné jádro
- pokud je vektorem fág → cestou infekce buňky
3) amplifikace vektoru v hostitelských buňkách
- rekombinované plazmidy se množí
4) selekce těch, které obsahují namnožený vektor
- selekce je zásadní krok, geny pro rezistenci na antibiotika umožňují selekci buněk nesoucích
vektor se zabudovanou cizorodou DNA
- během inzerce DNA do plazmidu se může do plazmidu dostat i sekvence bez požadovaných
vlastností, nebo může dojít ke spojení plazmidů → nejsou rezistentní vůči antibiotikům
5) identifikace buněčných klonů, obsahujících požadovaný cizorodý gen
- detekce DNA sondou (komplementární řetězec nesoucí radioaktivní či jinak značené nukleotidy) nebo hledáním produktů genu (proteinů), např. fluorescenčními protilátkami
Limity techniky:
1) pouze malé množství DNA může být vloženo do vektoru (speciálně upravené fágové vektory
kosmidy - mají větší rozsah)
2) mnoho genů pro svou funkci potřebuje regulační sekvence nebo jiné geny
- YAC = umělý kvasinkový chromosom – vektor splňující požadavky: nese všechny potřebné
součásti chromosomu - centromeru, telomery, sekvenci zajišťující počátek replikace; a může do něj být vnesena cizorodá DNA v rozsahu 300 000 – 1,5 milionu pb
replikace uvnitř bakterií),
bakteriofág nebo cosmid (vektor vzniklý spojením DNA plazmidu s cos sekvencí
některých virů), který je určen k přenosu cizí DNA a zajistí její expresi (a tím i
produkci cizorodých látek)
- viry jsou i přirozenými vektory při přenosu genů z jednoho druhu organismů na druhý
(onkoviry jsou vektory onkogenů zodpovědných za nádorovou transformaci buňky)
- i když plazmidy tvoří jen zlomek celkové bakteriální DNA, jsou pro ně důležité – často
nesou vitální geny , např. geny pro rezistenci na antibiotika
Vektory musí obsahovat:
- promotor – nutný pro zahájení transkripce, aktivuje DNA - závislou RNA polymerázu
- specifické sekvence – vazebná místa pro navázání RNA polymerázy (mRNA na ribosom)
- iniciační kodon ATG
- terminátor
- gen pro selekční systém, resp. marker
- gen jehož přenesení je našim cílem
Klonování genů - namnožení určitého úseku DNA pomocí klonovacího vektoru, který obsahuje
vložený úsek cizorodé DNA → vložen do organismu (např. do E. coli, kvasinky), tam
namnožení vektoru
- klasický vektor pro klonování v E. coli je plazmid pBR322 (obsahuje geny pro
rezistenci na ampicilin a tetracyklin) – jeho součástí je promotor pro beta-laktamát
Klon – populace DNA molekul vzniklých replikací jediné molekuly
5 kroků klonování:
1) inzerce cizorodé DNA do vektoru
- plazmidy nebo fágový genom jsou pro rekombinaci upravovány: odstranění nepotřebných
sekvencí a vložení genů (např. pro rezistenci na antibiotika)
- vektory obsahují dále rekogniční sekvence pro řadu restrikčních enzymů
- přítomnost restrikčních míst umožňují inzerci DNA fragmentů (rozštěpení plazmidu i cizorodé
DNA restriktázou → lepivé konce se pomocí DNA ligázy spojí kovalentní vazbou)
2) vnesení vektoru do hostitelských buněk
- transformací - přímý vstup DNA přes plazmatickou membránu a buněčné jádro
- pokud je vektorem fág → cestou infekce buňky
3) amplifikace vektoru v hostitelských buňkách
- rekombinované plazmidy se množí
4) selekce těch, které obsahují namnožený vektor
- selekce je zásadní krok, geny pro rezistenci na antibiotika umožňují selekci buněk nesoucích
vektor se zabudovanou cizorodou DNA
- během inzerce DNA do plazmidu se může do plazmidu dostat i sekvence bez požadovaných
vlastností, nebo může dojít ke spojení plazmidů → nejsou rezistentní vůči antibiotikům
5) identifikace buněčných klonů, obsahujících požadovaný cizorodý gen
- detekce DNA sondou (komplementární řetězec nesoucí radioaktivní či jinak značené nukleotidy) nebo hledáním produktů genu (proteinů), např. fluorescenčními protilátkami
Limity techniky:
1) pouze malé množství DNA může být vloženo do vektoru (speciálně upravené fágové vektory
kosmidy - mají větší rozsah)
2) mnoho genů pro svou funkci potřebuje regulační sekvence nebo jiné geny
- YAC = umělý kvasinkový chromosom – vektor splňující požadavky: nese všechny potřebné
součásti chromosomu - centromeru, telomery, sekvenci zajišťující počátek replikace; a může do něj být vnesena cizorodá DNA v rozsahu 300 000 – 1,5 milionu pb
Žádné komentáře:
Okomentovat