64.1

64. rekombinace DNA (přirozená a uměle navozená)

Přirozená

            Při rozmnožování pomocí gamet dochází na několika úrovních k rekombinaci genetické informace rekombinací genů a to při segregaci chromosomů, při crossing overu a při oplození. Z toho vyplývá, že potomci jistých rodičů nemohou být geneticky s nimi shodní, mají jinou, tj. rekombinovanou genetickou informaci. Tyto genetické rekombinace jsou hlavním zdrojem genetické variability a tím zdrojem variability ve fenotypových vlastnostech mezi jedinci téhož druhu. Genetická individuální variabilita má zásadní význam pro evoluci eukaryontních organismů.

            Segregace chromozomů – Rozchod chromozomů do gamet je náhodný jev. Všechny somatické buňky, a tedy i buňky zárodečného epitelu, z nichž meiózou vznikají gamety, vznikly mitotickým dělením zygoty, v níž každý pár homologických chromosomů je tvořen jedním původně mateřským a druhým otcovským chromosomem. Při meióze se chromosomy každého páru rozcházejí zcela nezávisle na rozchodu párů ostatních a v gametách jsou proto původní mateřské a otcovské chromosomy náhodně ,,promíchány“. Pravděpodobnost, že gameta při meióze získá kompletní mateřskou nebo otcovskou sadu chromosomů je tím menší, čím větší je počet chromosomů v sadě. Meiotická segregace chromosomů patří mezi hlavní zdroje genetické variability gamet.

            Crossing-over – Z průběhu I. Profáze meiózy vyplývá, že při crossing overu dochází k překřížení nesesterských chromatid a pak k výměně jejich některých úseků. Protože nesesterské chromatidy představují odlišné, původně mateřské a otcovské chromosomy, jsou také částečně vybaveny odlišnými alelami. Crossing overem vznikají tzv, rekombinované chromatidy a z nich pak po homeotypickém dělení i rekombinované chromosomy obsahující části původně mateřských i otcovských homologických chromosomů. Rekombinované chromosomy obsahují tedy nové kombinace alel vzhledem k původním jednotlivým rodičovským chromosomům.
Překřížení je náhodný jev a v určité frekvenci, která se odhaduje na 5 %, může nastat ve kterémkoliv místě u všech homologických chromosomů. Nastává i vícenásobné překřížení, které pak způsobuje reciproční výměnu několika úseků homologických chromosomů. Významnou poruchou meiózy může být nerovnoměrný crossing over, jehož důsledkem je ztráta (delece) v jedné a zdvojení (duplikace) ve druhé chromatidě. Crossing over je mechanismem rekombinace alel mezi homologickými chromosomy, zvyšuje genetickou variabilitu gamet a podobně jako meiotická segregace chromosomů je významným prostředkem, kterým sexuální proces přispívá ke zvýšení genotypové variability. Oba zmíněné mechanismy rekombinace, meiotická segregace chromosomů a crossing over, mají náhodný charakter, a proto výsledná pravděpodobnost výskytu identity chromosomové sestavy gamety rodiče a potomka je součinem pravděpodobnosti výskytu genově stejně vybavených gamet v důsledku segregace a pravděpodobnosti crossing overu. Hlavním procesem charakterizujícím pachytene je genetická rekombinace. Rozumí se tím vytvoření nových kombinací nukleotidových sekvencí ve vazbové skupině v průběhu crossing-overu. Pro průběh rekombinace jsou pravděpodobně nezbytné tzv. rekombinační noduly, poprvé popsané u drosofily Carpenterem, které se jeví jako tmavé vejčité struktury 0,2 mikro m dlouhé, zabudované do centrálního elementu synaptonemálního komplexu. Objevují se hned, jakmile vzniknou synapse, a přetrvávají do konce pachytene. Zpočátku jsou početné a nahodile rozloženy v centrálním elementu. Později v pachytene se redukují přibližně na jeden v každém rameni chromozómu. Zdá se, že počet a lokalizace rekombinačních nodulů velmi těsně koreluje s chiasmaty pozorovatelnými později v profázi I. Experimenty nasvědčují tomu, že synaptonemální komplex je ribonukleoproteinová síť produ-kující enzymy a faktory nutné k rekombinaci a rekombinační noduly jsou jejich seskupením. Také se zjistilo, že v pachytene je syntetizována skupina histonů, které jsou zcela specifické pouze pro meiózu (nevyskytují se v nukleosomech somatických buněk). Pravděpodobně s tím souvisí i další nález – krátké segmenty DNA pachytenních chromozómů v rozsahu 50 až 550 párů bazí jsou chráněny před natrávením DNAázou (jsou to ty části chromatinového vlákna spojené s laterálním elementem synaptonemálního komplexu, kde nastává rekombinace).

            Rekombinace při oplození – Proces splynutí obou gamet je jevem náhodným a kterékoliv vajíčko může být se stejnou pravděpodobností oplozeno kteroukoliv spermií, která je v těsné blízkosti. Vajíčko nese genetickou informaci od matky, spermie od otce. V obou gametách genetická informace již prošla rekombinací při meiotické segregaci a crossing overu. Splynutím obou gamet dochází k další náhodné rekombinaci, a to mezi genomem matky a otce. To znamená, že ve skutečnosti je každý diploidní jedinec vzniklý sexuální reprodukcí geneticky jiný.

Uměle navozená

            Při praktickém provádění genových manipulací je nezbytně nutné spojovat různé molekuly DNA do nových funkčních celků. Genové inženýrství v tomto případě mohlo využít enzym, který je přítomen ve všech buňkách – DNA-ligázu. K nutnosti spojovat přerušená vlákna DNA dochází totiž i za normálních okolností v každé živé buňce, a to ve dvou případech. První případ je spojování poškozených řetězců DNA při jejich reparaci, druhým případem je syntéza DNA podle opožďujícího se řetězce. V obou zmíněných případech se spojování vláken DNA zúčastní enzym DNA-ligáza, který vytváří novou fosfodiesterickou vazbu mezi dvěma sousedními nukleotidy. Typickým příkladem spojování fragmentů DNA a vytváření rekombinovaných molekul DNA je konstrukce vektorů z plazmidů. DNA plazmidu i DNA, kterou chceme do plazmidu začlenit, musí být štěpeny stejnou restrikční nukleázou, která vytváří kohezivní konce. Za určitých podmínek dojde po smíchání fragmentů z obou molekul DNA k přikládání kohezivních konců k sobě a po spojení DNA ligázou se vytvoří rekombinované molekuly DNA. Tento postup byl poprvé použit v roce 1973. Tím byl vytvořen základ pro cílenou tvorbu nových rekombinovaných molekul DNA, neboť je to postup použitelný zcela univerzálně.