63.1

63. hybridizační metody v cytogenetice a molekulární genetice

            Významnou metodou je hybridizace získaných fragmentů DNA s jinou molekulou DNA – komplementární a značenou sondou. Hybridizace se provádí na pevných nosičích, na kterých je polynukleotid vázán a je současně schopen hybridizace, přestože kinetika této reakce je pomalá a relativně málo efektivní. Mezi varianty hybridizace na pevném nosiči patří dot-, blot- a slot- hybridizace, Southernův přenos, hybridizace RNA (northern blotting) a hybridizace in situ. Imobilizace vzorků se provádí nejčastěji na membrány z nitrátu celulosy nebo nylonu. Přenosu DNA na pevný nosič předchází depurinace, alkalická denaturace a neutralizace. Přenos se uskuteční buď prostou difuzí na podkladě kapilárních sil nebo za pomoci vakua nebo působením elektrického proudu (electroblotting). Malé fragmenty (do 1500 bp) se přenesou na membránu při použití difuze kapilární silou do 2 hodin, větší fragmenty (nad 15 kb) vyžadují i více než 15 hodin. Permanentní fixace na membránu se docílí např. působením UV světla. Vlastní hybridizace znamená reasociaci příslušných dvojic bazí podle specifického pořadí nukleotidů se sondou značenou radioaktivním nebo neradioaktivním markerem. Jde buď o úseky DNA (dvou nebo jednovláknové) klonované pomocí bakteriálního vektoru nebo syntetické oligonukleotidy. Méně často se používají tzv. ribosondy (cRNA). Senzitivita hybridizace závisí na čtyřech hlavních faktorech: délce (počtu bazí) a komplementaritě sondy, koncentraci sondy (a potlačení nespecifických vazeb), specifické aktivitě sondy dané aktivitou (koncentrací) navázaného markeru, koncentraci testované DNA přenesené a fixované na membráně. Potlačení nespecifických vazeb (např. prehybridizací se sonifikovanou lososí spermatickou DNA nebo prehybridizací sondy se sonifikovanou lidskou DNA) dovoluje vyšší koncentraci sondy při dodržení hybridizačních podmínek teploty, koncentrace solí aj. Reakční směs a kinetika hybridizační reakce jsou stanoveny obvykle empiricky. Po hybridizační reakci ve speciálním inkubátoru s termostatem následuje vymývání pufrem SSC o různé koncentraci (1 x SSC: 0.15 mol/l NaCl, 0.015 mol/l citrát trojsodný).
dot-, blot- a slot- hybridizace. Názvy jsou odvozeny od tvaru jednotlivých vzorků nanesených na membránu: dot- velmi pravidelný okrouhlý tvar, slot- velmi pravidelný protáhlý tvar, blot- ručně nanesený vzorek více méně náhodného tvaru. Reverzní blotting spočívá v tom, že na membránu je naopak nejprve fixována sonda a potom teprve hybridozována s DNA z vlastního zkoumaného vzorku.
Southernův přenos a hybridizace RNA (northern blotting). Tyto metody jsou zvláštní tím, že přenosu fragmentů DNA nebo RNA na membránu a následné hybridizaci předchází elektroforetické rozdělení. Elektroforetické separaci obvykle ještě předchází štěpení restrikční endonukleasou. Tato metoda dává dvojí informaci: interpretuje po vizualizaci proužků např. autoradiograficky nebo kolorimetricky jednak přítomnost a jednak velikost nukleové kyseliny, která hybridizovala s aplikovanou specifickou sondou. Northern blotting a hybridizace se používají nejčastěji k hodnocení úrovně genové exprese konkrétních mRNA, a proto kvantifikace nebo semikvantifikace se provádí k referenční kontrolní hybridizační sondě (např. aktin).

In situ hybridizace. Tato metoda je založena na tom, že hybridizace probíhá v morfologicky intaktní tkáni, v buňkách nebo na chromozomech, které jsou fixovány na mikroskopickém sklíčku. Demonstruje se genetická informace v morfologickém kontextu a metoda sdružuje standardní světelnou mikroskopii s detekcí hybridizace. Hybridizaci se značenou sondou může předcházet amplifikační reakce (nepřímá in situ PCR). Přímá in situ PCR inkorporuje marker vázaný na oligonukleotidový primer nebo na dNTP přímo. Následuje obvykle detekce protilátkou a vizualizace. Celý proces může být automatizován. Příkladem je metoda FISH (fluorescenční in situ hybridizace). Velmi speciální metodou je analogicky přímá a nepřímá in situ RT-PCR (reverzní transkripce a amplifikace cDNA), která využívá vlastností rekombinantní rTth DNA polymerasy.