62.1

62. izolace a analýza nukleových kyselin

Izolace DNA

            Pro analýzu DNA je ve většině případů nezbytné získat tuto nukleovou kyselinu v dostatečně vysoké čistotě. Dříve používaná metoda založená na organických rozpouštědlech (fenol-chloroformová extrakce) je dnes již standardně nahrazována izolací pomocí silikátových kolonek, která nevystavuje DNA tak drastickým podmínkám (nepoužívá organická rozpouštědla), umožňuje velmi snadné a rychlé získání DNA ve vysoké čistotě a dík masovému rozšíření je i levná.

            Většina protokolů pro izolaci DNA se skládá z několika společných kroků: rozrušení a odstranění buněčných membrán (detergenty – Nonidet P-40, Triton X100). Odstranění proteinů (vysrážení, degradace proteinázou K). Odstranění RNA (RNáza, fázové oddělení). Rozpuštění/eluce izolované DNA (voda, TE pufr – Tris + EDTA).

            Fenol-chloroformové extrakce – jak již bylo uvedeno výše, je tato metoda založena na izolaci pomocí organických rozpouštědel. Extrakce je založena na zmíněných obecných principech a probíhá ve zkratce takto:

Buňky jsou nejdříve lyzovány pomocí detergentu. Buněčný lyzát je posléze promíchán se směsí fenol-chloroform. Zde je naprosto nezbytné použít pufrovaný fenol o mírně alkalickém pH (7-8). V kyselém pH by totiž DNA přešla do organické fáze a extrakce by byla neúspěšná. Vodná fáze se opatrně odsaje tak, aby se nezvířila ani vrstvička proteinů na rozhraní. Rozpuštěná DNA se následně vysráží v etanolu, opláchne v 70 % etanolu a rozpustí ve vodě či TE pufru.

            Izolace pomocí silikátových kolon – izolace DNA pomocí silikátových kolon je dnes patrně nejrozšířenějším způsobem izolace nukleových kyselin. Metoda je založená na schopnosti DNA se díky negativnímu náboji na fosfátových skupinách vázat v přítomnosti chaotropní soli (schopnyvytvářet vazby zároveň se záporně nabitým sklem i záporně nabitou DNA) na silikátovou náplň kolon. Izolace probíhá v několika krocích, kdy jsou do kolony aplikovány buněčný lyzát a oplachovací, resp. lyzační pufry, které jsou následně pomocí centrifugace či vakuem protlačeny kolonou.

Lýza buněk pomocí detergentu. Odstranění proteinů pomocí proteinázy K. navázání DNA na silikátovou náplň kolony – v přítomnosti chaotropní soli dojde k odstranění vodného obalu a DNA se přes kationty váže na záporně nabité silikátové skupiny. Oplach navázané DNA -  v přítomnosti vysoké koncentrace soli zůstane DNA navázána na kolonu a ostatní molekuly se odstraní při oplachu. Eluce navázané DNA – v přítomnosti nízké koncentrace soli (voda či TE pufr) dojde k uvolnění navázané DNA.

            Využití izolované DNA (RNA) v klinické praxi – takto izolovanou DNA (RNA) je následně možné využít pro řadu aplikací, jako je např.: stanovení rizika onemocnění, stanovení či upřesnění diagnózy, stanovení prognózy a stavu onemocnění, forenzní účely (určení oběti, identifikace pachatele, …), stanovení paternity i celých rodokmenů, detekce patogenů.

Amplifikace DNA

            Amplifikace DNA v buňkách – Pro detekci a analýzu DNA většinou dnes dostupných metod je zapotřebí velkého množství kopií. Počet molekul běžně dostupných pro analýzu je však většinou příliš malý a je tedy zapotřebí provést jejich zmnožení. Jednou z možností je zmnožení pomocí hostitelských buněk, ve kterých je tato DNA amplifikována. Pro tyto účely jsou často využívány bakterie Escherichia coli, do kterých je DNA vložena v podobě extrachromozomální DNA, tzv. plazmidu. Plazmid je malá kruhová molekula DNA schopná reprodukce, která se vyskytuje v cytoplazmě hostitelské buňky často ve větším počtu kopií. Aby plazmid mohl plnit svoji funkci, musí obsahovat několik základních oblastí, které mu to umožní. Pro vytvoření kopií sama sebe musí obsahovat počáteční místo replikace (tzv. ori), pro možnost selekce buněk s plazmidem (např. při využití v molekulárním klonování) musí obsahovat znak, který umožňuje selekci buněk obsahujících plazmid (např. rezistenci na antibiotika) a většinou obsahuje i místo pro rozštěpení pomocí řady restrikčních endonukleáz pro sekvenčně specifické vložení DNA (tzv. polylinker). Amplifikace DNA v prokaryotním organizmu je poměrně rychlá (byť mnohem pomalejší něž při využití PCR), ale v určitých případech je zapotřebí amplifikovat delší úseky DNA, popř. amplifikovat DNA v podmínkách eukaryotních buněk (např. kvůli specifické metylaci DNA v eukaryotech, atd.). V těcho případech lze využít i eukaryotické tkáňové kultury.

            Polymerázová řetězová reakce (PCR) – v roce 1983, kdy byla polymerázová řetězová reakce (PCR) poprvé použity, znamenala velký průlom v metodách molekulární genetiky a diagnostiky a její objevitel Kary Mullis získal za tento objev o deset let později Nobelovu cenu. Samotná metoda umožňuje geometrickou amplifikaci specifického úseku DNA ve velmi krátkém čase (desítky minut až hodiny). Kromě vysoké rychlosti patří mezi výhody PCR i její vysoká citlivost (pro vznik dostatečného počtu kopií pro analýzu stačí pouze několik molekul původní DNA) a s určitými modifikacemi umožňuje použít jako zdrojový materiál i RNA, což lze využít pro stanovení míry transkripce vybraných genů (viz dále v textu). Její provedení je však velmi náročné na čistotu prostředí, neboť každá případná molekula kontaminace může být v průběhu reakce amplifikována do obrovského počtu kopií a příprava PCR tedy vyžaduje zkušený personál.

Amplifikace DNA pomocí PCR – Pro amplifikaci pomocí PCR musí být vybraná oblast DNA ohraničena známými sekvencemi, ke kterým je možné navrhnout krátké úseky jednořetězcové DNA, tzv. primery. DNA polymeráza totiž neumožňuje syntézu nového řetězce podle jednovláknové DNA, která vznikla po denaturaci původní DNA (templátu), ale vyžaduje alespoň krátký úsek dvouřetězcový, který může prodloužit. Po denaturaci DNA pomocí zvýšení teploty na 95 °C a následné změně podmínek (snížení teploty), kdy dojde k opětovnému tvoření dvouvláknové DNA, nasedají primery, které jsou v reakční směsi v nadbytku, na komplementární sekvence amplifikované DNA a vytvářejí krátké dvouvláknové úseky, které umožní nasednutí polymerázy a následné prodloužení DNA. Vzhledem k tomu, že používané polymerázy jsou stabilní i při vysokých teplotách, je možné reakci řídit prostou cyklickou změnou teplot. Opakováním těchto kroků v přístrojích zvaných termocyklery se sledovaná DNA geometricky množí a po 30 cyklech můžeme získat teoreticky až miliardu kopií DNA z jediné původní molekuly.

PCR v reálném čase – Dalším pokrokem ve využití PCR byl objev tzv. PCR v reálném čase, která umožňuje stanovení počtu vznikajících kopií DNA v průběhu samotné PCR a ne až na jejím konci, jak tomu bylo dříve. Detekce v reálném čase je dosaženo pomocí měření fluorescence specifických či nespecifických barviv v průběhu PCR. Nespecifická barviva se váží na dvoušroubovicovou DNA, v komplexu se kterou fluoreskují podobně jako ethidium bromid v případě barvení DNA v elektroforetickém gelu (viz. Obr. 2.2). Etidium bromid se však příliš neosvědčil a pro PCR v reálném čase se využívají jiné barvy, jako např. SYBR Green I. Tento přístup je však velmi citlivý na vznik nespecifických produktů PCR, které mohou vzniknout při nasednutí primerů na podobné sekvence DNA či vzniku dimerů primerů. Tento problém vyřešil až příchod sekvenčně specifických sond, jako jsou např. tzv. TaqMan sondy. TaqMan sondy jsou specifické oligonukleotidy komplementární k DNA mezi sekvencemi PCR primerů, které obsahují na 5‘ konci fluorescenční značku (fluorofor) a na 3‘ konci zhášeč. Zhášeč zabraňuje emisi fluorescenčního záření fluoroforu po jeho předchozí excitaci a sonda tedy není schopna v tomto neporušeném stavu fluoreskovat. V případě, že sonda nasedne v průběhu PCR do amplifikované oblasti, je DNA polymerázou, která má 5‘ – 3‘ exonukleázovou aktivitou, rozštěpena (hydrolyzována). Tím se zhášeč vzdálí od fluoroforu a dochází k emisi fluorescenčního signálu. Stoupající intenzita tohoto signálu, měřená v reálném čase, je přímo úměrná zvyšujícímu se množství amplifikované DNA. Specifických sond je více druhů. Jsou to např. tzv. molekulární majáky (molecular beacons), kdy je zhášeč držen v blízkosti fluoroforu pomocí vlásenkové struktury sondy nenavázané na produkt PCR reakce. Vznik vlásenkové struktury je umožněn díky komplementárním sekvencím na obou koncích sondy. V případě, že se sonda naváže na amplifikovanou DNA, dojde k narušení vlásenky, zhášeč se oddálí od fluoroforu a ten může po excitaci vyzářit signál. Další možností je použití páru hybridizačních sond, které nasedají vedle sebe v amplifikované oblasti. Jedna sonda obsahuje excitační část fluorescenční barvy a druhá část emisní. V případě, že obě sondy nasednou na cílovou sekvenci, obě části se k sobě přiblíží a po excitaci jedné části dojde pomocí přenosu rezonanční energie na druhou část k vyzáření fluorescenčního signálu, jehož intenzita odpovídá počtu sond, které nasedly vedle sebe na amplifikovanou molekulu DNA.

Kvantitativní PCR v reálném čase – Významné rozšíření možností PCR způsobilo její zkombinování s v té době již známou reverzní transkriptázou, za jejíž objev získal v roce 1975 Nobelovu cenu David Baltimore. Reverzní transkriptáza je RNA-dependentní DNA polymeráza, tedy enzym, který provádí obrácený proces, než který se odehrává při transkripci. Reverzní transkriptáza umožňuje přepsat poměrně nestabilní molekuly RNA, které jsou velmi snadno štěpené pomocí všudypřítomných RNáz (proto je s RNA nutné pracovat velmi opatrně a při teplotách 4 °C), na molekuly mnohem stabilnější komplementární DNA (cDNA), které je možné dále analyzovat. Nejčastěji pomocí kvantifikační PCR v reálném čase. Kvantitativní PCR v reálném čase je založena na faktu, že při vyšším počtu kopií původní DNA (resp. cDNA) v měřeném materiálu dosáhne fluorescence stejné intenzity (počet produktů PCR dosáhne stejného počtu) ve všech vzorcích po méně cyklech PCR, než při nižším počtu kopií. Optimální míra intenzity, tzv. fluorescenční práh lze v software pro analýzu PCR nastavit buď ručně nebo automaticky pomocí algoritmů výrobce. Při vytvoření vhodné kalibrační přímky lze vyčíst podle bodu křížení, což je číslo cyklu, při kterém křivka narůstající fluorescence protla fluorescenční práh, spočítat přesný počet kopií dané DNA ve vzorku. Tento typ kvantifikace se proto nazývá absolutní. Vzhledem k tomu, že materiálu není ve všech vzorcích vždy stejně, používá se často kvantifikace relativní, kdy výsledkem není přesný počet kopií, ale exprese vztažená na hodnotu exprese známého genu, který je ve všech buňkách exprimovaný stejně a zajistí tak normalizaci napříč všemi analyzovanými vzorky. Mezi takovéto často používané geny patří např. GAPDH, aktin, B2M, HPRT1. Relativní exprese může být počítána jako poměr individuálně změřené absolutní exprese studovaného i udržovacího genu, což však vyžaduje vytvoření kalibračních přímek pro oba geny v každé sadě reakcí. Velmi rozšířenou metodou relativní kvantifikace je proto metoda delta delta Ct. Tato metoda založená na porovnání exprese sledovaného genu ve studovaném vzorku a v referenčním vzorku (např. před léčbou nebo standardu o známém počtu kopií) z čísel bodů křížení křivek a fluorescenčních prahů. Metoda však předpokládá, že účinnost všech reakcí je rovna (nebo alespoň blízká) 100 %, což vyžaduje důkladnou optimalizaci kvantifikačních reakcí. Díky kvantitativní PCR v reálném čase lze měřit míru transkripce genů s vysokým dynamickým rozsahem až deseti řádů. Při použití analýzy intenzity fluorescence produktů na elektroforetickém gelu po skončení klasické PCR je možné dosáhnout rozsahu pouze několika řádů a to pouze za předpokladu, že je analýza provedena opravdu v oblasti exponenciálního průběhu PCR a ne již ve fázi plateau, kdy se množství produktu dále nemění.

Detekce mutací - PCR v reálném čase také umožňuje sledovat přítomnost známých mutací bez nutnosti otevřít reakční zkumavku, což snižuje riziko kontaminace laboratoře produkty reakce a časovou náročnost celého procesu. Systém může být založen na detekci pomocí hydrolyzačních sond, jako v případě kvantifikace pomocí PCR v reálném čase. Systém pak obsahuje 2 sondy, z nichž každá je komplementární k jiné alele (1. k divoké a 2. k mutované) a je značená jiným fluoroforem (např. sonda komplementární k divoké alele fluoroforem vyzařujícím zelené a k mutované žluté světlo). Nárůst signálu jedné (homozygoti), resp. obou barev (heterozygot) je detekována přímo v průběhu amplifikace. Na odlišném principu je založena metoda detekce pomocí hybridizačních sond. Pár sond leží opět vedle sebe na DNA produktu PCR reakce, jak bylo popsáno v části pojednávající obecně o PCR v reálném čase. Místo možné mutace je umístěno pod jednou z páru sond, která je plně komplementární k divoké alele. Po amplifikaci pomocí PCR se vzorek ochladí na dostatečně nízkou teplotu, aby obě sondy nasedly na PCR produkt bez ohledu na přítomnost či nepřítomnost mutace a při ozáření tak došlo k maximální fluorescenci. Reakční zkumavka se postupně zahřívá a průběžně se měří míra fluorescence. V případě, že všechna DNA obsahuje mutaci (pacient je mutovaný homozygot), dojde při určité teplotě k uvolnění ne plně komplementární sondy, což je zaznamenáno, jako pokles fluortescence. Jestliže je pacient heterozygotní, uvolní se polovina sond při této teplotě a druhá polovina až při teplotě vyšší, neboť plně komplementární DNA potřebuje k denaturaci více energie. U homozygota v divoké alele pak dojde k jednorázovému poklesu fluorescence při vyšší teplotě.

Digitální PCR – Další metodou, založenou na amplifikaci DNA pomocí PCR, je tzv. digitální PCR. Tato metoda je založená na rozdělení vzorku pro běžnou PCR do spousty malých reakcí. Podle výsledné pozitivity (1) nebo negativity (0) dílčích reakcí je možné určit absolutní množství sledované molekuly v původním templátu bez kalibrační křivky, popř. detekovat i molekuly zastoupené v původním vzorku ve velmi malé koncentraci (somatické mutace, změny exprese onkogenů, kvantifikace patogenů atd.). Rozdělení na malé reakce je možné dosáhnout dvěma způsoby. Reakce je možné provádět na čipu, na kterém je reakční směs rozdělena do velkého počtu miniaturních komůrek nebo je směs rozdělena v emulzi s olejem, ve kterém se vytvoří malé kapičky reakční směsi, ve kterých PCR probíhá.V obou případech se provede klasická PCR. Na základě měření fluorescence nespecifických či specifických fluorescenčních sond je následně v jednotlivých komůrkách či kapénkách stanoveno, zda reakce proběhla či nikoli. Ze získaných výsledků je možné pomocí Poissonova rozdělení (které zohledňuje i fakt, že v některých pozitivních komůrkách či kapénkách byla víc než právě jedna molekula) vypočítat, kolik templátových molekul se v původním vzorku vyskytovalo.

PCR v klinické praxi - Samotná PCR slouží pouze k amplifikaci specifického úseku DNA, který může být následně analyzován za účelem odhalení mutací či polymorfizmů relevantních ke studovanému onemocnění. Toho je možné dosáhnout buď sekvenací DNA (jako v případě např. neznámých mutací ve vybrané části genomu) či analýzou známých mutovaných míst např. pomocí délky restrikčních fragmentů. Díky PCR v reálném čase je navíc možné detekovat, jak moc je který gen v buňkách transkribován, popř. lze zrychlit a zjednodušit hledání mutací či polymorfizmů sloučením analýzy se samotnou PCR. Přítomnost mutací či polymorfizmů navíc může vést ke změně prognózy onemocnění pacienta či může významně ovlivnit jeho reakci na předepsanou léčbu (včetně rezistence). PCR však může být použita i pro hledání DNA, která se běžně v lidských buňkách nevyskytuje, jako je např. DNA patogenů nebo specifických přestaveb vedoucích k některým maligním onemocněním, popř. ovlivňujících jejich průběh, čímž umožňuje zároveň velmi citlivě detekovat přítomnost maligních buněk ve vzorku, což může vést k časnějšímu záchytu relapsů onemocnění s vyšší šancí na úspěšnou léčbu. 

Analýza DNA

            Gelová elektroforéza – základní metodou analýzy nukleových kyselin je gelová elektroforéza, která umožňuje rozdělit fragmenty DNA, resp. RNA podle jejich velikosti. Analyzované nukleové kyseliny jsou po nanesení na gel přitahovány pomocí elektrického pole ke kladné elektrodě, neboť fosfátové skupiny v řetězci nukleových kyselin dávají těmto molekulám záporný náboj. Velké molekuly obtížněji prostupují póry v polymerní struktuře gelu a jejich posun je tudíž pomalejší. Pro rozdělení středně velkých fragmentů se nejčastěji používá agarózových gelů, které lze v laboratorních podmínkách velmi snadno připravit a se kterými se velmi snadno manipuluje. V případě potřeby rozdělení menších fragmentů lze použít polyakrylamidový gel, který má zároveň mnohem vyšší rozlišovací schopnost a lze v něm odlišit i fragmenty lišící se v délce o pouhou jednu bázi. Jejich příprava je však náročnější a manipulace s nimi obtížnější. Molekuly nukleových kyselin je možné následně obarvit pomocí nespecifických fluorescenčních barviv a vizualizovat. Nejčastěji používanou barvou je ethidium bromid, který byl původně vyvinut jako léčivo proti trypanosomovým infekcím, a který se díky své planární struktuře velmi dobře vmezeřuje mezi báze nukleových kyselin. V případě záření takto obarvené DNA pomocí UV (254 nm) dojde k absorpci energie bazí, předání energie barvivu a vyzáření v oblasti červeno-oranžové části spektra (590 nm). Takto obarvenou DNA pak lze pozorovat velmi snadno pod UV lampou.

            Southern blotting – fragmenty nukleových kyselin jsou o gelové elektroforéze zachyceny uvnitř polymerní struktury často křehkých gelů a specifická detekce fragmentů je tak velmi obtížná. Významnou změnu přinesl objev tzv. blottingu, který umožnil přenos molekul na membránu, která je mnohem pevnější a molekuly DNA jsou přichyceny na jejím povrchu. Northern blotting (RNA), western blotting (proteiny). Přenos z gelu na membránu lze provést několika způsoby. Mezi nejčastěji používané patří přenos v elektrickém poli (kdy je DNA z gelu na membránu přenesena kolmým působením elektrického pole na gel) nebo pomocí tzv. kapilárního přenosu. Při kapilárním přenosu je DNA z gelu přenášena pomocí kapaliny z vlhkého filtračního papíru ponořeného do pufru, která přes gel a membránu proudí do suchých filtračních papírů umístěných nad membránou. Tímto způsobem lze během krátké doby přenést malé fragmenty DNA. Větší fragmenty vyžadují delší čas, který se může pohybovat i v řádech desítek hodin a ani tak není metoda nikdy 100 % účinná, protože i samotný gel je v průběhu tohoto procesu dehydratován a postupně se mění v hustou substanci, ze které se další fragmenty DNA již nemohou uvolnit. DNA zachycenou na membráně lze pak detekovat pomocí specifických sond, jako jsou např. radioaktivně označené specifické fragmenty DNA komplementární k hledané sekvenci, které lze detekovat pomocí rentgenových filmů vykazujících přítomnost signálu (zčernání) v oblasti, kde se nacházela DNA komplementární k sondě, popř. pomocí jiných metod, např. chemiluminiscence.

            Restrikční endonukleázy – enzymy schopné štěpit DNA v určitých, sekvenčně specifických, oblastech. Původně byly objeveny jako enzymy chránící bakteriální DNA před DNA cizorodou (zejména bekteriofágů), neboť vlastní DNA byla před štěpením chráněna další modifikací (zejména metylací) a jakákoli cizorodá DNA bez modifikace byla tímto enzymem rozštěpena. V dnešní době je již známa celá řada endonukleáz, které štěpí velkou řadu různých sekvencí, které jsou zpravidla identické při čtení z obou stran komplementárních řetězců (tzv. palindromy). Sekvenčně specifické štěpení za vzniku tupých či kohezivních konců je možné použít nejen při hledání známých specifických mutací, ale hojně se využívá i v metodách molekulárního klonování pro tvorbu specifických DNA konstruktů. Tzv. tupé konce mají oba řetězce zakončené ve stejném místě a vzniklé fragmenty DNA tak nemají žádný jednořetězcový přesah. Takovéto konce je možné spolu spojovat nespecificky (HpaI). Druhá skupina restrikčních endonukleáz vytváří tzv. kohezivní konce, kdy vznikají jednovláknové přesahy (EcoRI, HindIII, PstI). Takové fragmenty je možné spojovat pouze s fragmenty s komplementárním přesahem (nejčastěji vzniklých štěpením jiné molekuly pomocí stejné endonukleázy).

            DNA chipy (microarrays) – potřeba vysokého počtu analýz v co nejkratším čase vedla ke vzniku technologie DNA chipů, tzv. microarrays. Technologie je založena na hybridizaci analyzované DNA a synteticky připravených sond na základě jejich komplementarity. Sondy jsou imobilizované na nějaké matrici (např. sklo) do bodů, z nichž každý odpovídá nějaké analyzované sekvenci a díky jeho přesně známé pozici je možné analyzovat, zda došlo či nedošlo (popř. s jakou intenzitou) k nachytání komplementární analyzované DNA. Současné technologie umožňují používat již tak malé body, že jich lze vtěsnat statisíce na jedno podložní mikroskopovací sklíčko a při jedné reakci tak lze provést obrovské množství analýz. V dnešní době lze tuto technologii využít pro celou řadu aplikací, jako jsou např. měření změny exprese genů v různých typech buněk, detekce ztrát či amplifikací genomové DNA, sledování epigenetických změn genomu či hromadné detekce jednonukleotidových polymorfismů (SNP).

Expresní arraye – patrně nejznámější variantou jsou tzv. expresní arraye, které umožní naráz stanovit změnu exprese stovek až tisíců genů. RNA ze sledované tkáně je nejdříve přepsána do cDNA a následně fluorescenčně označena (např. zeleně). Kontrolní RNA (např. ze zdravé tkáně) je též přepsána a obarvena jinou barvou (např. červeně). Směs obou cDNA je pak aplikována na expresní chip, který obsahuje přichycené sondy odpovídající sledovaným genům. cDNA komplementární se sondami se tak přichytí k matrici a místa se zachycenou cDNA po excitaci fluoreskují. Zbylá nepřichycená cDNA je opláchnuta a změnu exprese ve sledovaném vzorku oproti kontrolnímu je možné detekovat jako barvu jednotlivých bodů. V případě stejné exprese v obou vzorcích žlutě nebo do červena či zelena podle převažující exprese v jednom ze vzorků.

Komparativní genomová hybridizace – metoda, která umožňuje zjistit, zda nedošlo ke zvýšení či naopak snížení počtu kopií genetického materiálu ve vybraných (např. nádorových) buňkách. Jako materiál, který je obarven a následně hybridizován je použita genomová DNA ze sledovaných buněk a referenčních buněk. DNA chip pak obsahuje sondy z mnoha různých oblastí jednotlivých chromozomů a výsledná barva po hybridizaci směsi obarvených DNA ukazuje, zda byla ve sledovaných buňkách některá část genomu zmnožena (např. trizomie či mikroduplikace) nebo naopak chyběla (delece celého chromozomu nebo jeho části). Ze své podstaty není tato metoda pochopitelně schopna detekovat vyvážené translokace, kdy dojde k výměně částí chromozomů mezi sebou a nedojde k žádnému zmnožení či naopak ztrátě genetického materiálu.