61. klasické cytogenetické metody ve výzkumu a diagnostice

61. klasické cytogenetické metody ve výzkumu a diagnostice

            Mezi metody molekulární cytogenetiky patří vyšetření, která zkoumají DNA na chromosomální úrovni na základě molekulárně genetických principů. Tyto metody jsou především FISH, CGH, a různé druhy array. Jejich hlavním účelem je tedy zjistit různé submikroskopické chromosomální aberace, které jsou špatně zachytitelné klasickým vyšetřením karyotypu v optickém mikroskopu.

            FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – jedná se o metodu, která umožňuje lokalizaci a identifikaci specifické sekvence nukleotidů DNA, popř. RNA. Metoda využívá procesu denaturace a reasociace DNA. Pojem hybridizace znamená, že se podle pravidel komplementarity spojí vlákno vyšetřované DNA s druhým vláknem, kterým je sonda, která bývá označená. K hybridizaci dochází přímo ve vyšetřovaném biologickém materiálu, tedy na místě (in situ), nikoli na izolované DNA. Jako vyšetřovaný vzorek mohou být využity chromozomy z buněk v metafázi, interfázní jádra nebo celé buňky například z histologických řezů. Používají se fluorescenčně značené sondy.

Princip – vyšetřovaná nukleová kyselina nejprve musí být denaturována. Dojde k rozrušení vodíkových můstků mezi bázemi a oddělení řetězců. Tímto způsobem získáme z původní dvoušroubovice DNA dva jednoduché polynukleotidové řetězce. Po navození reasociačních podmínek je na ně poté podle pravidel komplementarity bází navázán krátký a značený úsek nukleové kyseliny, tzv. sonda. Navázání sondy na vyšetřovanou DNA se projeví jako hybridizační signál, který můžeme pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu.

Denaturace – denaturaci neboli oddělení polynukleotidových řetězců lze vyvolat působením zvýšené teploty (94-96 °C), některými chemickými sloučeninami nebo specifickými enzymy. Teplota, při které je v roztoku denaturováno 50 % DNA, se nazývá teplota bodu tání (Tm) a závisí na mnoha faktorech: na podílu párů GC (čím vyšší, tím vyšší teplota), na koncentraci solí v roztoku (čím vyšší, tím vyšší teplota), na pH (výrazně vyšší nebo nižší pH než 5-6 způsobí destabilizaci DNA), na přítomnosti denaturačních činidel v roztoku (formamidu, močoviny, hydroxidů).

Postup – příprava materiálu (kultivace, izolace jader, resp. chromozomů atd.). Denaturace sondy (fluorescenčně značená) a cílové DNA – vysokou teplotou (společně nebo odděleně). Hybridizace sondy a cílové DNA – ochlazením (37 °C). Odstranění nespecifických signálů (provádí se působením formamidu nebo roztokem o nízké iontové síle za současného zvýšení teploty a sonda se tak odstraní z míst, k nimž není zcela komplementární). Vyhodnocení pod fluorescenčním mikroskopem.

Sondy – sonda je uměle připravený polynukleotidový řetězec, který se naváže na cílovou DNA. Aby bylo možné pozorovat hybridizační signál, musí být sonda značená.

            Značení

Přímé – umožňuje pozorovat hybridizační signál ihned po skončení hybridizace. Fluorescenční barvivo – fluorochrom (FISH), radioaktivní izotop.

Nepřímé – sonda je značena haptenem (látkou s antigenními vlastnostmi) který je následně detekován pomocí značené protilátky. Hybridizační signál je možné zesílit (amplifikovat). Je také možné protilátku konjugovat s enzymem, který katalyzuje vznik barevné reakce. Biotin – detekován avidinem s fluorochromem.

                                   Typy sond

Satelitní (telomerické, centromerické) – hybridizují s oblastmi obsahujícími satelitní sekvence. Vyšetření aneuploidií.

Lokus specifické – hybridizují s jedinečnými sekvencemi DNA (jednotlivými geny, popř. skupinou genů). Vyšetření mikrodelecí u mikrodelečních syndromů a malignit a některých specifických translokací.

Malovací – hybridizují s mnohočetnými chromosomovými sekvencemi, lze jimi označit celý chromosom. Nelze použít na interfázních jádrech. Vyšetření chromosomových přestaveb.

Pro prokázání složitějších přestaveb lze použít metodu mnohobarevné FISH (mFISH) nebo spektrálního karyotypování (SKY), při kterých je použito více sond značených různými fluorochromy.

            CGH (komparativní genomová hybridizace) – umožňuje analýzu celého genomu v jediném experimentu. Vychází z principu FISH a z tohoto pohledu ji je možné definovat jako „kvantitativní, dvoubarevnou, obrácenou“ FISH. To vypovídá o omezení jejího použití na detekci kvantitativních (nebalancovaných) změn genomu, k čemuž je použito 2 vzorků DNA značených dvěma rozdílnými fluorochromy. Jako sonda je tedy využita DNA izolovaná z vyšetřované tkáně.

Metoda – po izolaci 2 vzorků DNA jsou tyto vzorky označeny dvěma rozdílnými fluorochromy. Jedním vzorkem je DNA odebraná z vyšetřované tkáně, která je standardně značena zeleným fluorochromem. Druhým vzorkem je kontrolní (referenční) DNA značená červeným fluorochromem. Tyto sondy jsou pak společně hybridizovány s normálními chromozomy. Výsledek hybridizace je pak snímán fluorescenčním mikroskopem, karyotypován a počítačově vyhodnocen.

Vyhodnocení – DNA vyšetřovaného jedince a referenční DNA v podstatě „kompetují“ o vazebná místa na chromozomech. V závislosti na tom, zda je určitý úsek vyšetřované DNA amplifikován, či deletován, pak ve výsledku v různých místech chromozomu převládá fluorochrom vyšetřované, nebo referenční DNA.

Použití – metoda CGH nachází uplatnění především v onkocytogenetice při zjišťování nebalancovaných chromozomálních aberací u nádorů. Umožňuje identifikovat místa v genomu, kde došlo k delecím, nebo amplifikacím, a které tak mohou mít souvislost se vznikem či vývojem nádorového onemocnění.

Výhody – mezi pozitiva metody patří možnost celogenomového screeningu bez potřeby kultivace buněk. Dále je to detekce aberantních míst bez předešlé znalosti jejich umístění v genomu.

Nevýhody – jako nedostatky metody pak můžeme považovat nemožnost odhalit aberace, které nedoprovází kvantitativní změna genetického materiálu. Dále je limitující potřeba alespoň 50 % zastoupení aberantních buněk ve vzorku. Z principu metody také vyplývá, že nelze odlišit diploidní a tetraploidní tumory. Limitující je pak i rozlišovací schopnost CGH.

            Metoda hybridizačních čipů (array) – metoda mikročipů spočívá v tom, že jsou v jednotlivých jamkách čipu fixovány sondy se známou sekvencí DNA. Při přidání značené vyšetřované DNA se fragmenty váží k sondám se známým umístěním – víme, že pokud dané místo na čipu fluoreskuje, nachází se ve vyšetřovaném genomu sekvence komplementární k sondě v tomto místě. Jednou z možností využití této metody je array-CGH, vyšetření vycházející z principu CGH. Porovnáváme zde množství opií lokusu na vyšetřovaném a standardním genomu ne na celém chromosomu, ale po jednotlivých úsecích dle jamek v čipu. Druhou platformou je tzv. SNP-array, která je založena na detekci SNP, tedy jednonukleotidových polymorfismů, opět na principu hybridizace oligonukleotidových sond na čipu. Tato metoda umí oproti array-CGH i blíže rozlišit např. uniparentální disomii (UPD) či ztrátu heterozygozity (LOH), oproti array-CGH však má o něco horší rozlišení. Array metody jsou dnes metodou volby při vyšetření osob s podezřením na některý z mikrodelečních syndromů, tedy např. u dětí s psychomotorickou retardací (PMR) a nespecifickou kraniofaciální dysmorfií.