60.1

60. testování cytotoxicity in vitro

            Všechny materiály, které mají být implantovány do lidského organismu, musí být testovány na toxicitu pro buňky a tkáně organismu, na karcinogenitu, tj. zda nevyvolávají v organismu zhoubné bujení, a konečně, zda jejich přítomnost nevyvolá nežádoucí imunitní reakce. Série testů je obvykle zahajována testováním cytotoxicity. Tyto testy se dělí do několika skupin podle toho, co testovaná látka v buňce ovlivňuje.

            Viabilita – testy spočívají v porušení membránové integrity, vymezené vychytáním barviva, pro které je normálně buněčná membrána nepropustná (např. trypanová modř), nebo uvolněním barviva či izotopu, který je ve viabilních buňkách normálně zadržován (např. diacetyl fluorescein, neutrální červeň, laktát dehydrogenáza). Viabilní buňky vychytávají diacetyl fluorescein a hydrolyzují jej na fluorescein, pro který je membrána živých buněk nepropustná. Živé buňky fluoreskují zeleně, mrtvé buňky nefluoreskují. Neviabilní buňky mohou být obarveny ethidium bromidem nebo propidium jodidem a fluoreskují červeně. Agar difúzní test, filtrační test.

            Proliferace – účinek chemických látek na buněčnou proliferaci je určován nárůstem počtu buněk. To se dá provést měřením celkového buněčného proteinu (Brillantova modř nebo Coomasie modř), DNA (inkorporací radioaktivně značených nukleotidů) nebo ATP (identifikací síly luminiscence). Dnes měření poměru ATP/ADP, protože viabilní buňky zachovávají tento poměr konstantní a tato hodnota je lepším indikátorem toxického účinku látky na buňku než samotná hodnota ATP.

            Metabolická aktivita – tyto zkoušky se soustřeďují na biologické funkce uvnitř intaktních buněk jako alternativa k testům permeability. Ve viabilních buňkách jsou tetrazoliové soli redukovány extramitochondriálními dehydrogenázami na barevné formazanové sloučeniny. Produktem této reakce je buď nerozpustný formazan, nebo ve vodě rozpustné formazany, které nevyžadují kvantitativní extrakci. Tyto testy jsou prováděny na 96-jamkových destičkách, což je časově i finančně výhodnější. MTT, XTT, WST-1.

            DNA čipy a microarrays – většina xenobiotik pravděpodobně přímo nebo nepřímo ovlivňuje molekulární signalizaci, a tím mění expresi genů. Nová disciplína in vitro toxikologie – toxikogenomika – se zaměřuje na tuto problematiku použitím vyspělých technologií zvaných DNA čipy (microarrays). DNA microarrays tvoří pevný základ, na který jsou aplikovány tisíce sekvencí DNA. Ty mohou být navázány na skleněné podložky nebo nylonové a nitrocelulózové membrány. Ukotvené DNA jsou použity k identifikaci cílových sekvencí od kontrolních a léčených jedinců a určení vlivu toxické látky na vzestup či pokles genové exprese.

            V některých testech je zkoušený materiál v přímém kontaktu s buňkami, v jiných je kontakt materiálu nepřímý, např. přes vrstvu agaru (agar difúzní test) nebo přes ultrafiltr (testy na membránovém ultrafiltru Millipore). Některými testy lze hodnotit pouze pevné materiály, jiné jsou vhodné i pro materiály tekuté nebo výluhy z materiálů pevných.

            Agar-difúzní test – nasazení buněk – překrytí vrstvy buněk vrstvou agaru – přidání neutrální červeni, buňky se obarví – testovaný vzorek položen na vrstvu agaru – po 24 hod změřena velikost odbarvené plochy.

            Test metabolické aktivity MTT (transformace thiazolylové modře) – nasazení buněk na filtr, kultivace 24 hod – příprava Petriho misky s vrstvou agaru – filtr s buňkami položen na agar buňkami dolů – testovaný vzorek umístěny na filtr – po 24 hod barvení MTT a měření odbarvené zóny.