60.
Testování cytotoxicity in vitro
Doporučuji prolítnout přednášku od Králový (LS4). Jsou tam
obrázky k testům.
Testování na bb. kultůrách je tu od toho, aby nahradilo
testování na lidech či spíše zvířatech, což bylo v minulosti celkem populární
(např.: stanovení letální dávky LD50). To se moc nelíbilo... dnes
testy na zvířatech regulovány organizacemi FRAME, ZEBET... čili testování
toxicity na bb. kulturách je taková alternativa, která se snaží přiblížit
kvalitám testování na živých tvorech. Dnes je to důležité především pro
testování léčiv a cokoli, co má jít do lidského těla.
Taková látka by měla projít:
- testy na toxicitu – mutagenicitu (karcinogenitu) – testy
na nežádoucí imunitní reakce
Testy na cytotoxicitu
Dělí se do skupin, podle toho, co testovaná látka v b.
Ovlivňuje:
-
viabilita
test založen
na porušení membránové integrity. Rozlišení živá/mrtvá
- neutrální
červeň – v živé b. se hromadí v lyzosomech
- diacetyl
fluorescein – vychytáván živou b. a rozkládán na fluoreskující fluorescein
(zelený)
- trypanová
modř – pronikne do mrtvé b.
- ethidium
bromid, propidium jodid – barvení neviabilních bb. - červená fluorescence
- +
filtrační test a agardifúzní test (viz. níže)
-
proliferace
Účinek látek
na bb. proliferaci – určování nárůstu bb.:
- Přímé pozorování - (časosběrná videomikroskopie)
- celkový
buněčný protein – briliantová modř, Coomasie modř
- DNA
– inkorporace radioaktivně značených oligonukleotidů
- ATP
– identifikace podle síly luminiscence
- dnes
se zjišťuje poměr ATP/ADP – konst. u viabilních bb.
-
metabolická aktivita
Alternativa k
testům viability (permeability membrán)
- tetrazoliové
soli jsou redukovány extramitochodriálními dehydrogenázami a vznikají rozpustné
ve vodě nebo nerozpustné ve vodě formazany
- 96
jamkových destiček
-
DNA čipy a microarrays
Vzestup, nebo
pokles genové exprese – DNA,RNA, proteiny
- viz
ot. DNA čipy a microarrays (63)
TESTY:
-
agar difuzní test
- neutrální
červeň – (pinocytźa) živé buňky jsou obarveny červeně , neviabilní ztrácí
zbarvení, protože NČ difunduje z lyzosomů do relativně velké agarové zóny
- thiazolová
modř – viabilní buňky dehydrogenázami přeměňují thiazolovou modř na modré
ve vodě nerozpustné formazány; neviabilní bb. zůstanou žluté
- následuje
mikroskopické hodnocení, archivace – fotky Petriho misek
-
ultrafiltry (Millipore)
- průkaz
sukcinát dehydrogenázové aktivity (SDH)
- viabilní
bb. se barví modrofialově a buňky neviabilní se nebarví
- není
možno hodnotit mikroskopicky (filtr není transparentní)
- průkaz
přeměny diacetyl fluoresceinu na fluorescein (FDH)
- mrtvé
buňky se nezbarví
- barví
se živé bb. - jsou schopny uskutečnit tuto reakci
- gró
metody spočívá v nepropustnosti membrány pro produkt – fluorescein
- buňky
budou fluoreskovat zeleně
-
mikrotitrační destičky
- stanovení
metabolické aktivity
- 96
jamek
- průkaz
dehydrogenázové aktivity
- tetrazoliová
sůl je dehydrogenázami přeměněna na ve vodě rozpustné oranžové formazány
- fotometrické
zhodnocení – aktivní bb. jsou zbarveny
- též
možnost nepřímého kolorimetrického měření celkových proteinů – Brilliant Blue
testy mutagenicity (možná to taky budou chtít)
Amesův test
SCE (výměna sesterských chromatid)
Transgenní myš Big Blue
(viz Králová (10)ZS biologie nádorů 2)
Žádné komentáře:
Okomentovat