59.1

59. kultivace buněk in vitro

            Termín in vitro v překladu z latiny znamená „ve skle“. Tato metoda se používá v biologii, medicíně a dalších příbuzných oborech a je založena na pěstování buněčných (popř. tkáňových) kultur mimo organismus, ze kterého pochází.

            Aby kultivace byla úspěšná, je zapotřebí odebranou tkáň či soubor buněk co nejrychleji přenést do živného roztoku nebo média. Toto médium se svým chemickým složením a fyzikálními vlastnostmi snaží co nejvíce přiblížit přirozenému prostředí v těle, tedy tělním tekutinám (lymfě, krevní plazmě, mozkomíšnímu moku atd.). musí se přísně kontrolovat koncentrace solí a organických živin, hodnota pH (7,1-7,4; max 6,8-7,8), teplota prostředí 37°(35-38), ve kterém se vzorek vyvíjí, a mnoho dalších faktorů (5 % CO₂ v atmosféře, médium izotonické, obsah média – ionty, glukóza, 13 AK, 8 vitamínů, stopové prvky, hormony, proteiny, krevní sérum 5-10 % - jako zdroj růstových a adhezivních faktorů, detoxikační funkce, antibiotika – přísná sterilita). Velký důraz se musí klást na sterilitu používaných nástrojů, aby nedošlo k infikaci dané kultury. Nezbytnou součástí živného média je sérum, které iniciuje buňky k dělení, a tedy i růst celé kultury. Další součástí tohoto média jsou antibiotika, aby se předcházelo infekci, a tedy i zániku celé kultury. V případě úspěšné kultivace se nám buňky začínají množit a vzniká buněčná (resp. tkáňová) kultura. Tyto kultury se pěstují zpravidla na Petriho miskách v termostatu při stálé teplotě 37 °C. Po určité době se ovšem živné médium vyčerpá a je nutné část buněk odebrat a přenést do jiné kultivační nádobky s čerstvým živným roztokem. Tento proces se nazývá pasážování buněk a je nutné ho pravidelně opakovat.

            Růstová křivka buněčné kultury – růst buněk v kultuře probíhá charakteristicky a lze ho popsat pomocí tzv. růstové křivky.

Lag fáze – první fáze, počet buněk nejprve mírně klesne (adaptace buněk na médium) a poté začíná narůstat. Období disperze – po nasazení jsou buňky nejprve kulaté, volně pohyblivé. Období uchycování – buňky začínají sedimentovat a adherovat k podložce. Období rozprostírání – buňky se oplošťují a roztahují do charakteristického tvaru.

Log fáze – počet buněk exponenciálně roste, buňky využívají pro svůj metabolismus všechny živiny, v této fázi jsou buňky vhodnými objekty pro cytogenetické vyšetření.

Stacionární fáze – růst buněk se zastaví, začíná se projevovat vyčerpání živin, hromadění metabolitů a toxinů.

Fáze odumírání – konečná fáze, udržení kultury již není možné, protože došlo k vyčerpání živin, poklesu pH, hromadění metabolitů (např. CO₂) a toxinů, v této fázi je nutné převést buňky na nové médium.

            Druhy buněčných kultur

Primární – skládají se z buněk přímo odebraných z organismu. Tento typ kultury má pouze krátkou životnost, která se počítá jen na několik dní, poté je třeba buňky převést do nového média (pasážování). V primárních kulturách dochází především k vyselektování buněk, které jsou lépe přizpůsobené kultivačním podmínkám.

Buněčné kmeny – buněčné kmeny vznikají na základě primárních kultur z buněk, které byly už alespoň jednou pasážovány. Jedná se o kulturu normálních diploidních buněk, které vydrží 40-50 dělení a poté zanikají (senescence).

Buněčné linie – představuje kulturu buněk, které mají prakticky neomezenou životnost a schopnost neomezeného buněčného dělení. Tento typ kultury vzniká z buněčných kmenů procesem transformace nebo mohou být izolovány přímo z živé tkáně (např. nádorové buňky). HeLa buňky, jako první izolované z karcinomu děložního hrdla Henrietty Lacksové.

Většina buněčných linií má omezenou životnost, tj. podléhá stárnutí a po určité době se buňky přestanou dělit. Pouze některé tkáňové kultury jsou nesmrtelné – zpravidla jde o buňky získané z nádorů nebo uměle imortalizované vnesením vhodných genů. V tom případě se hovoří o kontinuálních buněčných liniích. I v nich si buňky obvykle zachovávají schopnost regulace buněčného dělení. Pokud ji ztratí a dělí se nekontrolovaně, mluvíme o transformované buněčné linii.

Velká většina buněčných linií vyžaduje k růstu vhodný povrch – adherentní kultury, jen některé typy buněk dokáží přežívat a dělit se v suspenzi.

Organotypické kultury – napodobení trojrozměrné situace ve tkáni.

            Kultivační půdy – jedná se o substráty poskytující vhodné životní podmínky pro růst mikroorganismů. Lze je využít k průkazu a učení vlastností některých mikroorganismů.

                       Půdy můžeme rozdělovat podle skupenství na tuhé (pevné) a tekuté (kapalné).

                       Základní půdy – jsou bohaté na živiny a růstové faktory. Patří sem bujón.

            Obohacené půdy – používají se ke kultivaci růstové náročnějších bakterií, které potřebují speciální růstové faktory. Mohou být obohacené např. o AK, vitamíny, cukry apod. Typickým příkladem je krevní agar obohacený o růstový faktor hemin, který je nezbytný např. k růstu hemofilů.

            Selektivní půdy – na selektivních půdách rostou jen určité organismy a používají se tedy, pokud chceme daný druh izolovat. Toho dosahujeme buď přidáním látek, které mají baktericidní účinky na určitý druh, anebo naopak že médium bude chudé na určité látky nezbytné pro růst nežádoucích organismů. Löwensteinova-Jensenova půda.

            Diagnostické půdy – tyto půdy se používají pro rozlišení více druhů organismu nacházejících se na jednom médiu. Toho je docíleno většinou rozdílným zabarvením jednotlivých kolonií, což je způsobeno např. rozdílným metabolismem určité látky, jejíž produkty pak reagují s indikátorem v půdě. ENTEROtest.

            Selektivně diagnostické půdy – jsou kombinací selektivních a diagnostických půd. Obsahují inhibitory a indikátory a jsou proto specifičtější než předchozí dvě. Endova, DC agar.

            Transportní půdy – jsou určeny k přepravě vzorku do laboratoře. Obsahují minimum živin, aby nedošlo k přemnožení a zkreslení kvantity mikroorganismu ve vzorku. Amiesovo a Stuartovo médium.

Využití v biomedicíně – lékařská genetika, metody asistované reprodukce, transplantace – tkáňové banky, toxikologie, screening a vývoj nových farmaceuticky zajímavých látek, tkáňové inženýrství.