59.
Kultivace buněk inervace vitro
Buňky se kultivují při stálé teplotě
(pro savčí buňky 37C, maximální rozmezí 35 – 38C), nejlépe v termostatu se
stálou tenzí CO2. Obvykle se využívá atmosféry s 5% příměsí CO2, čímž se
podporuje lepší funkce bikarbonátového pufru, který zajišťuje optimální pH
kultivačního pro-středí na hodnotách 7,1 – 7,4 (maximální rozmezí pH 6,8 –
7,8). Pro snazší kontrolu pH se přidává do média indikátor – fenolová červeň. V
alkalickém prostředí má fialovou barvu, při optimálním pH je médium sytě
červené. Čím je médium vyčerpanější a kyselejší, mění se barva na oranžovou až
světle žlutou.
Veškeré potřebné živiny se buňkám
dodávají v kultivačním médiu. Je to izotonický roztok (buňky tolerují odchylky
v rozmezí 10 % od této hodnoty) řady nízko a vysokomolekulárních látek. Jsou to
hlavně ionty anorganických solí (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, PO43-, SO42-,
HCO3-), glukóza jako zdroj energie, 13 aminokyselin (z 20 aminokyselin běžných
v bílkovinách), 8 vita-mínů (např. kyselina listová, inositol, nikotinamid,
kyselina pantotenová, pyridoxin, riboflavin), některé stopové prvky, hormony,
ale i bílkoviny. Dnes se komerčně vyrábí více než 20 druhů různých médií –
jednodušších (Hanks, Earle) i složitějších (Eagle, RPMI) pro kultivaci buněk
nejen savců, ale i hmyzu a rostlin.
Doposud nezbytnou součástí přesně
definovaných médií pro aktivní růst buněk je určitý podíl (5 – 10 %) krevního
séra. Slouží především jako zdroj různých růstových a adhezivních faktorů,
které usnadňují přichycení buněk k podkladu ve stacionární kultuře. Bílkoviny
séra mimo jiné mají i funkci detoxikační a zároveň zvyšují viskozitu
kultivačního média. Nejvhodnější séra jsou z mladých zvířat,
krmených tradičním způsobem – telecí a bovinní sérum, pro náročnější kultivace
se užívá i fetální telecí sérum. Jen málo buněčných linií nevyžaduje přítomnost
séra (obvykle se jedná o transformované buňky, které mohou růst i v suspenzní
kultuře).
Práce s buňkami pěstovanými in
vitro vyžaduje dodržování přísné sterility. Do média se běžně
přidávají antibiotika (PNC, STM), ale i ostatní ingredience a veškeré materiály
musí být sterilní (užívá se horkovzdušná sterilizace, autoklávování, filtrace
přes speciální filtry). Vlastní práce s kulturami se provádí v tzv. laminárních
boxech, které lze fyzikálně sterilizovat (UV záření, filtrování vzduchu apod.). Všechny
použité chemikálie včetně vody musí být nejvyšší čistoty; materiály
musí reagovat neutrálně a musí být v kultivačním prostředí inertní – speciální
silikonová pryž, nerezová ocel, speciální „tkáňové“ sklo. Výrobky z těchto
materiálů musí před použitím pro-jít speciálním mycím postupem – mechanické
odstranění nečistot, chemická úprava povrchu, dokonalé odstranění použitých
mycích prostředků, sušení, balení do nehořlavého papíru a sterili-zace.
Vzhledem k časové náročnosti tohoto postupu se dnes stále více užívají výrobky
z plastických materiálů pro jedno použití.
Žádné komentáře:
Okomentovat