58.1

58. pozorování živých buněk v mikroskopu

Mikroskopie – způsob, jak pozorovat a studovat buňky (tkání, orgánů, těl) morfologicky, funkčně, molekulárně

            Rozlišení – nejmenší vzdálenost dvou bodů, které jsme schopni ještě rozpoznat jako dva body (nesplynou)

            Zvětšení – možné zvětšení a přiblížení sledovaných struktur

            Kontrast – rozlišení (nepodobnost) tvarů a barev

            Světelná mikroskopie – E. Abbe 1873 – vysvětluje princip vzniku obrazu v mikroskopu. Umožňuje pozorovat věci, které již naše oko nedokáže rozlišit

                       Části – osvětlovací soustava (kondenzor), objektiv, okulár, mechanická část

Osvětlovací soustava – k osvětlení preparátu, nejčastěji proti směru pozorování. Preparát je pak částečně průhledný.

Objektiv – soustava čoček s velmi krátkou ohniskovou vzdáleností. Dohromady fungují jako spojná čočka (předmět převrácený, skutečný, zvětšený)

Okuláry – soustava čoček, které fungují jako spojka. Funkce lupy (obraz zdánlivý, přímý, zvětšený)

            Fluorescenční – jev, při kterém fluorochrom absorbuje světlo o určité vlnové délce a emituje jiné o delší vlnové délce. Každá fluorescenčně aktivní látka má specifické absorpční a emisní spektrum. Primární – fluoreskuje vlastní předmět. Sekundární – fluoreskuje látka v předmětu.

Autofluorescence – přirozená vlastnost některých molekul v buňkách. Porfyriny, vitamíny, chlorofyl, lipofuscin.

Jednoduchá fluorescence – baví více či méně specificky určité struktury v živé buňce či tkáni na základě chemických vlastností fluorochromů. Akridinová oranž, Rhodamin 123, DAPI.

Akridinová oranž – DNA a RNA molekuly. Fixované buňky (DNA žluto-zeleně, RNA oranžově – diferenciální barvení). Živé buňky (pH – dependentní barvení lysozomů)

DAPI a Hoechst – A T baze DNA. Fixované buňky (DAPI barví DNA modře). Živé buňky (Hoechst 33285 barví DNA modře)

Konjugovaná fluorescenční barviva – fluorochrom kovalentně navázán na molekulu, která má schopnost se specificky vázat na určitou buněčnou strukturu. Phalloidin + FITC, Phalloidin + TRITC (na F-aktin)

Imunofluorescence – založená na aplikaci komplexu fluorochromu navázaného na monoklonální protilátku vytvořenou specificky proti určité struktuře (molekule). Primární – sekundární protilátka s fluorochromem. Přímá (fluorochrom je navázán na primární protilátku, která se váže na určitou strukturu). Nepřímá (fluorochrom se váže na sekundární protilátku, ta na primární a ta na strukturu).

Fluorescenčně značené DNA sondy – fluorescenční barvivo je navázáno na DNA, která se používá jako sonda k označení komplementární sekvence.

Fluorescenční proteiny – první GFP (green fluorescent protein) objeven v 60. letech (Aquorea sp. – Osamu Shimomura), jako marker. Nejde o vnášení barviva do buňky, ale genetické informace pro tvorbu fluorescenčního proteinu. Transgenní organismy exprimují fluorescenční protein ve svých buňkách.

Princip – elektron po absorpci energie přejde do excitovaného stavu a při přechodu zpět energii vyzařuje ve formě fotonu o vyšší vlnové délce

Části – zdroj světla, excitační filtr, dichroické zrcadlo, objektiv, emisní filtr, detektor

            Zdroj světla – všechny vlnové délky

Excitační filtr – ze zdroje propustí pouze světlo o takové vlnové délce, která excituje příslušné fluorescenční barvivo.

Dichroické zrcadlo – excitační světlo odráží na vzorek, emitované propouští

Objektiv – slouží zároveň jako kondenzor

Emisní filtr – propouští světlo odpovídající emisnímu spektru fluorochromu

Detektor

                       Výhody – vysoká citlivost, rychlost a specifita, bezpečnost, nativní i fixované

            Nevýhody – nativní – toxicita (ne fluorescenční protein), vysvícení (photobleaching), nákladné

Mikroskopie dnes – důraz na živé objekty. Kritické body (biologie modelu, čas, typ mikroskopie

Intravitální mikroskopie – zobrazení v živém organismu, umožňuje pohled na jednotlivé orgány a děje bez nutnosti poručení jeho integrity, tedy neinvazivně

Fázový kontrast – živé objekty (buňky) na světlém poli – malý kontrast mezi buňkou a okolím i mezi jednotlivými subcelulárními strukturami = detaily jsou neviditelné. Paprsky se při průchodu vzorkem zpomalují a lomí, toho využívá mikroskop s fázovým kontrastem. Po průchodu vzorkem se paprsky rozdělí podle indexu lomu struktur, kterými prošly. Lomené paprsky jsou zpožděny nejvíce o ¼ vlnové délky, nelomené nejsou zpožděny. Posun o ¼ vlnové délky nestačí k dosažení potřebného kontrastu

Princip – Prstenčitá clona je opticky v zákrytu s fázovou destičkou objektivu. Propustí světlo ve formě prstence. Kondenzor pak světlo formuje do tvaru pláště kužele, jehož špička dopadá na vzorek. Paprsky lomené strukturami ve vzorku a zpožděné ve fázi jsou nasměrovány do jiného prstence fázové destičky, než paprsky nelomené. Tím se zvětší rozdíl ve fázi mezi lomenými a nelomenými paprsky. Při skládání obrazu z různých druhů paprsků dojde k interferenci. Změny ve fázi jsou převedeny na změny v amplitudě = jasnosti.

Konfokální laserová skenovací – zdrojem světla je laser, který excituje určitou vlnovou délku, a přes vodovou clonu a objektiv osvětluje preparát. Stejným objektivem prochází světlo odražené. Paprsky prochází dichroickým zrcadlem a pokračují k bodové cloně, kde dochází k odfiltrování světla z jiných rovin. Paprsky vstupují do fotonásobiče, kde jsou zesíleny a detekovány. V jednom kroku získáme informaci pouze o jednom budu – pro získání obrazu z celé roviny je potřeba udělat sérii snímků.

Bodová clona – nastavitelná clona. Definuje tloušťku optického řezu. Pomáhá odclonit paprsky přicházející z prostoru pod a nad rovinou ostrosti. Výsledkem je velmi ostrý obraz bez šumu v pozadí.

Rastrování probíhá posouváním paprsku pomocí clony (skeneru) postupně do všech bodů roviny. Pokud je postupně nasnímáno dostatečné množství rovin, je možné pomocí počítače složit 3D model. Je využíván při studiu povrchových vlastností materiálů, prostorových struktur buněk, architektury neuronových sítí, koncentrace iontů, membránový potenciál, pH, topologie buněčného jádra.

Výhody – vysoká citlivost, automatizovanost, 3D rekonstrukce, specifická detekce

Nevýhody – nákladnost, pracnost, fiované objekty

Dvoufotonový mikroskopie – využívá skutečnosti, že fluorescenci požadované fluorescenční látky je možno vyvolat nejen jedním fotonem o požadované vlnové délce, ale také dvěma zároveň absorbovanými fotony o vlnové délce dvojnásobné. Absorpce několika fotonů zároveň je za normálních okolností velmi nepravděpodobné a dojde k ní jen za použití velmi silných a nákladných laserů a navíc jen v rovině ostrosti. Působí jen v rovině ostrosti, nedochází k velkému photobleachingu, světlo snadno proniká i velmi hluboko do vzorku.

Light sheet – ozařuje v jednom okamžiku  vždy jen tenký plátek vzorku, čímž omezuje poškození živé tkáně excitačním paprskem. Světlá „stěna“ postupuje vzorkem a do počítače se ukládají virtuální řezy, z nichž se pak skládá 3D obraz. Síla ozářené vrstvy je v řádu stovek nanometrů až několika milimetrů. Velká rychlost snímání.

STED (vyčerpání stimulovanou emisí) – využívá možnosti vyčerpat energii z fluoroforu stimulovanou emisí. Zároveň s excitačním světlem se fluorofor osvětlí světlem s delší vlnovou délkou, které způsobí, že místo fluorescenčního záření se vyzáří světlo o vlnové délce excitačního záření, které je odfiltrováno. Paprsek laseru s vyšší vlnovou délkou má na průřezu tvar mezikruží, takže ke zhášení fluorescence dochází pouze u okraje oblasti osvícené excitačním laserem. Fluorescenční záření tak vzniká pouze v nezhášené oblasti uvnitř mezikruží, čímž dochází ke zlepšení rozlišení. Rozlišení závisí na tom, jak moc dokážeme omezit oblast, v níž nedochází k vyčerpání fluorescence. Ta je limitována intenzitou záření laseru s delší vlnovou délkou a u biologických vzorků limituje nejlepší dosažitelné rozlišení, protože při přílišné intenzitě osvětlení dochází k poškození vzorku. V praxi se maximální rozlišení pohybuje okolo 60nm.