26.1

26. translace – průběh, regulace a posttranslační modifikace proteinů

Translace

            Genetická informace je zakódována v molekulách nukleových kyselin a transkribována z DNA do RNA jediným jazykem, který používá nukleotidy s bazemi A, G, C, T (U). Způsob zápisu genetické informace do DNA nazýváme genetický kód. Primárním smyslem genetické informace je zajištění přísné specifity syntezovaných bílkovin. Struktura peptidového řetězce je však psána odlišným jazykem tvořeným AK, což znamená, že pro vlastní proteosyntézu musí být genetická informace přeložena. Tento překlad – translace – je vždy jednosměrný (nukleové kyseliny à bílkoviny).

            Genetický kód – jakýsi šifrovací klíč o 4 písmenech. Gen obsahuje tolik genetické informace, kolik je jí potřeba k „formulaci“ struktury jedné molekuly mRNA (proteinu). Kodon je sekvence tří po sobě následujících bází v DNA a sekundárně v mRNA, tzv. triplet bazí. Jeden triplet bází kóduje jednotku informace pro zařazení jedné specifické AK do peptidového řetězce.

Fenylalanin (Phe – UUU, UUC), leucin (Leu – UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), izoleucin (Ile – AUU, AUC, AUA), methionin (Met – AUG – začátek translace), valin (Val – GUU, GUC, GUA, GUG), serin (Ser – UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC), prolin (Pro – CCU, CCC, CCA, CCG), threonin (Thr – ACU, ACC, ACA, ACG), alanin (Ala – GCU, GCC, GCA, GCG), tyrosin (Ryr – UAU, UAC), konec translace (UAA, UAG, UGA), histidin (His – CAU, CAC), glutamin (Gln – CAA, CAG), asparagin (Asn – AAU, AAC), lysin (Lys – AAA, AAG), kyselina asparagová (Asp – GAU, GAC), kyselina glutamová (Glu – GAA, GAG), cystein (Cys – UGU, UGC), tryptofan (Trp – UGG), arginin (Arg – CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG), glycin (Gly – GGU, GGC, GGA, GGG).

Sekvence nukleotidů v tripletech jsou vyjádřeny ve směru 5´à3´. 4 báze tvoří celkem 4³ = 64 různých tripletů. 61 z nich kóduje 20 AK nutných pro výstavbu bílkovin. 3 triplety – UAA, UAG, UGA – nekódují AK, ale značí ukončení translace (tzv. terminační kodony). Všechny organismy operují v podstatě s týmž genetický kódem (s určitými odchylkami) – kód biologicky universální.

Nepřekryvný – informace je čtena postupně, jeden kodon po druhém, ve směru 5´à3´.

Wobble pozice – třetí pozice v kodonu (méně popisující než první dvě). Zde mohou být U a C přečteny G v antikodonu a stejně A a G přečteny U. Na tRNA zde může být Indosin (I), který čte A, U, C.

            mRNA je překládána na ribosomu do primární struktury bílkoviny. Přitom je každá AK zařazována na své místo v peptidovém řetězci „svou“ tRNA. Každá molekula tRNA je totiž schopná navázat molekulu pouze jediné AK a současně nese specifický antikodon, tj. triplet bází komplementární ke kodonu mRNA. Každá buňka syntezuje tolik různých typů tRNA, kolik kodonů pro jednotlivé AK má mRNA, tj. 61. Jsou to tedy molekuly tRNA, které překládají jazyk NK do jazyka proteinů a to tím, že jejich antikodony řadí AK do sledu, určeného pořadím kodonů.

            Proteosyntetický aparát

mRNA – nese informaci pro vytvoření peptidového řetězce o specifické primární struktuře.

tRNA – zařazuje molekuly AK do pořadí určeného mRNA.

Ribosomy – zajišťují prostorovou souhru a časovou dynamiku funkčních složek proteosyntézy.

            Materiálem pro výstavbu proteinů jsou volné molekuly AK, energii dodává ATP (4 ATP na jednu peptidovou vazbu). Celý proces je řízen složitou souhrou enzymů a vyžaduje řadu pomocných faktorů.

            mRNA – v eukaryotických buňkách je mRNA syntezována v jádře. Po posttranskripční modifikaci přechází póry jaderného obalu do cytoplasmy, kde je na ribozomech využita v proteosyntéze. V prokaryontní buňce je mRNA syntezována i translatována v jediném v jediném buněčném kompartmentu. Řetězec eukaryontní mRNA kóduje pouze jeden peptidový řetězec, zatímco prokaryontní jich kóduje více. Eukaryontní je stálá, prokaryontní nestálá. Prokaryontní mRNA jsu různá, některá nesou transkript pouze jednoho strukturního genu (monocistronická) nebo několika genů (polycistronická). Ty jsou syntezovaný podle úseku DNA, kde je skupina za sebou umístěných, funkčně příbuzných genů operonu (transkripční jednotka). V extrémních případech se mohou překrývat (A na konci terminálního kodonu je součástí AUG kodonu iniciace). Ribosomy se však váží vždy na začátek každého cistronu (strukturní gen) a po přečtení terminačního kodonu disociují. Kódující oblast začíná kodonem AUG a končí kodonem UAA, UAG, UGA. Jednotlivé kódující oblasti jsou navzájem odděleny nekódujícími oblastmi.

            tRNA – asi 80 nukleotidů, 3´konec tvoří purin-CCA, 5´konec – G. Úseky řetězce tvoří sekvence nukleotidů komplementární k sekvencím na jiných místech řetězce. Tyto úseky se vzájemně váží vodíkovými můstky. Získává strukturu s 3 až 4 dvouřetězcovými rameny zakončenými jednořetězcovými smyčkami (tvar lístku jetele). Rameno aminokyselinové tvoří 5´i 3´konec, kde se na purin-CCA váže AK. Rameno antikodonové exponuje antikodon, který určuje AK. Má i charakteristickou terciární strukturu, která má vztah k ribozomům a je pro její funkci důležitá.

            Ribosomy – místa proteosyntézy. Složeny z rRNA a proteinů. Drobná zrnka, tvořená dvěma podjednotkami (větší a menší). Pokud proteosyntéza neprobíhá, jsou odděleny. Váží se při iniciaci proteosyntézy a vazba zaniká pro terminaci. Úplný ribozom existuje pouze při proteosyntéze. Prokaryontní má sedimentační konstantu 70S (velká 50S, malá 30S), eukaryontní 80S (velká 60S, malá 40S). Prokaryontní jsou rovnoměrně rozptýleny v cytoplasmě. Eukaryontní jsou v cytoplasmě (připojeny k cytoskeletu) a na vnějším povrchu endoplasmatického retikula (drsně ER). Mitochondriální a chloroplastové jsou velmi/úplně shodné s prokaryontními. Na velké podjednotce je několik vazebných míst.

                       Aminoacylové místo (A) – sem se váží jednotlivé aminoacyl-tRNA.

            Peptidylové místo (P) – váže se sem peptidyl-tRNA, tj. dosud nasyntezovaná část peptidového řetězce přes poslední navázané tRNA.

            Exitové místo (E) – zde mizí tRNA bez aminokyseliny. Dále ještě místa pro pomocné faktory elongace a terminace.

            Na malé podjednotce jsou místa pro iniciační faktory. Podstata funkce spočívá v přesné prostorové orientaci tRNA, aby byla zajištěna plynulost čtení genetické informace. Jedna mRNA se může „provlékat“ několika ribosomy – polysom. Polysom syntezuje tolik peptidových řetězců, kolik obsahuje ribosomů.

            Klinický význam – bakteriální ribosomy jsou cílem pro některá antibiotika. Některé bakteriální toxiny mohou zastavit proces proteosyntézy.

Proteosyntéza

            Přípravná fáze – před zahájením translace musí být aktivovány AK, k čemuž je využívána energie z ATP. Aktivované AK jsou pak enzymy aminoacyl-tRNA-syntázami připojeny na 3´OH konec své tRNA.

            Iniciace – dochází ke kontaktu AUG start kodonu na mRNA s iniciační tRNA nesoucí methionin. Celý proces koordinují iniciační faktory (eIFs), kterých jsou u eukaryont až desítky. V prvním kroku se na malou ribozomální podjednotku naváže iniciační tRNA-Met a iniciační faktory (eIF3, 4, 2 – v aktivní formě s GTP). Výsledný komplex se označuje jako preiniciační komplex. Na 5´guanosinové čepičce se naváže eIF4-helikáza, která rozmotává sekundární struktury (UTR – nepřekládané oblasti u obou konců; regulace). Dochází ke skenování mRNA, dokud není nalezen start kodon pro tRNA-Met (první kodon od 5´konce). Po rozpoznání start kodonu dojde k hydrolýze GTP na eIF2, disociaci zbývajících faktorů a připojení velké podjednotky. EIF2 zajišťuje, aby se iniciátor dostal na P-místo. Dále hydrolyzuje GTP na eIF5, který pomáhá navázat velkou podjednotku.

            Elongace – přidání každé AK probíhá ve 4 krocích, při nichž je AK přiřazena k tripletu nukleových bazí (1 z 20 proteinogenních AK). Probíhá to v dutinách ribozomu, na A-místě a P-místě. Účastní se elongační faktory. AK jsou v aktivovaném stavu připojené na tRNA pomocí aminoacyl-tRNA-syntázy. Do A-místa přichází aminoacyl-tRNA se správnou AK (pomáhá eEF1). pokud AK neodpovídá, je okamžitě vypuzena. Pokud odpovídá, eIF1 hydrolyzuje GTP. V další fázi je vytvořena vazba mezi peptidový řetězcem na P-místě a AK na A-místě. Dle dochází k posunu mRNA (pohybu ribosomu) tak, aby se uvolnilo A-místo. Napomáhá eEF2, který se vmezeří do A-místa a posune mRNA. Hydrolyzace GTP, odchod eEF2, další kolo. Na druhé straně v E-místě odchází tRNA bez AK.

            Terminace – pokud se do A-místa dostane kodon UAA, UAG, UGA, je proteosyntéza ukončena. Vzniklý polypeptid, uspořádaný do primární struktury, se uvolní. Procesu napomáhají tzv. uvolňovací faktory, které se naváží na A-místo ribosomu. Polypeptid se oddělí a rozpadne se ribozom.

Regulace – aktivita eIF4.

            mTOR (mechanic target of rapamycin) – proteinové kinázy působící na serin/threonin schopné regulovat proteosyntézu. (Inhibitory blokující jednotlivé kroky proteosyntézy – antibiotika).

Posttranslační modifikace

            Předpokladem funkce peptidového řetězce není jen vytvoření specifické sekundární a terciární prostorové struktury, nýbrž zpravidla i určitá chemická úprava jeho molekuly. Zkrácení peptidového řetězce, metylace určitých lyzinových zbytků, karboxylace postranních řetězců určitých AK, kovalentní připojení určité AK, acetylace NH₂-konce, glykosylace, fosforylace určité OH-skupiny specifickou protein-kinázou, modelace (chaperony), ubikvitinace (proteazom), sumoylace (navázání SUMO proteinu – stabilizace). Všechny úpravy probíhají v ER, GA a cytoplasmě. Mohou být trvalé i reverzibilní. Regulační systém aktivity strukturních, enzymových i signálních bílkovin. Umožňují, aby kterýkoli genový produkt byl „zapjat“ do své biologické funkce teprve na určitém místě, čase a s ohledem na okamžité funkční podmínky.

            Proteazomová degenerace

Proteazom – proteinový komplex v jádře a cytoplasmě. Hlavní funkcí je degradace nepotřebných nebo poškozených proteinů (proteázy). Jsou hlavním mechanismem, pomocí kterého buňky regulují koncentraci konkrétních proteinů a degradují špatně složené proteiny. Proteiny určené pro degradaci jsou označeny ubikvitinem. Válcovitý komplex tvořený 4 naskládanými kruhy (2 vnější z β-jednotek, vnější z α-jednotek). Aktivní místa štěpící proteiny jsou v β prstencích. β1 podjednotka s aktivitou podobnou kaspázám, β2 trypsinu, β3 chemotrypsinu. Významnou roli v proteasomové degradaci hraje malý protein ubikvitin („ubikvitní“ – všude se vyskytující). Ubikvitin je vázán v buňce za spotřeby ATP ubikvitin-aktivujícím enzymem E1. následně je přenesen na ubikvitin-přenášející (ubikvitin-konjugující) enzym E2. Další přesun ubikvitinu na protein je podmíněn ubikvitin-ligázou E3, která dokáže specificky rozpoznat protein, který má být degradován. E1 a 2 k přenosu ubikvitinu, E3 k navázání (hodně E3). vazba ubikvitinů v řetězec je přes lysin (48, 63).

Inhibitory proteazomu – inhibice proteazomu vede k apoptóze některých nádorových buněk (využití jako protinádorové léky – bortezomib).