25.1

25. transkripce – průběh, regulace a posttranskripční modifikace RNA

Transkripce DNA

            Informace v genech uložená může být transformována do konkrétních vlastností buňky, do jejího fenotypu – exprese genetické informace. Prvním stupněm exprese genetické informace je její přepis z DNA do RNA, tj. transkripce. Kódující sekvence DNA jsou transkripcí přesně připisovány do komplementárních sekvencí RNA, tedy opět do polynukleotidových řetězců, avšak poněkud odlišných chemicky, konformačně, funkčně. Tyto do RNA přepsané sekvence se obecně označují jako transkripty. Primární transkripty jsou zpravidla poněkud chemicky pozměněny, což označujeme jako posttranskripční úprava či modifikace.

            Syntéza RNA – jako matrice pro syntézu RNA slouží vždy jen jedno vlákno duplexu DNA, tzv. vlákno kódující. Vznikající řetězec RNA je tedy svou nukleotidovou sekvencí identický s druhým vláknem duplexu DNA s tou výjimkou, že místo nukleotidů s thyminem jsou do RNA zařazeny nukleotidy s uracilem.

RNA polymeráza – enzym katalyzující syntézu RNA. Přesně známá struktura prokaryontní polymerázy (2 podjednotky α, 1 podjednotka β, β´, σ)

Dvě funkční složky – dřeňový enzym (2α, β, β´), který katalyzuje elongaci ribonukleotidového řetězce. σ-faktor, který zprostředkuje vazbu enzymu na promotorové sekvence DNA a tak specifikuje iniciaci transkripce určitého genu.

U prokaryont katalyzuje 1 polymeráza všechny 3 typy RNA (m, t, r). U eukaryont známe 3 druhy jaderné RNA polymerázy, pro žádnou z nich ale není známo podjednotkové složení. RNA polymeráza I (v jadérku a sytezuje rRNA), RNA polymeráza II (v jádře a syntezuje heterogenní jadernou RNA, jež je prekurzorem mRNA (hnRNA), RNA polymeráza III (v jádře a syntezuje tRNA a četné malé jaderné RNA (sRNA).

            Iniciace

Prokaryonta – iniciována vazbou molekuly RNA polymerázy na dvouřetězcovou molekulu DNA. σ-faktor rozezná určité sekvence DNA a taj směřuje RNA polymerázu ke specifickému místu duplexu, zvanému promotor.

Pribnowova sekvence – sekvence 6 nukleotid (TATAAT), která je důležitou částí promotoru pro transkripci. Je rozpoznána a navázána RNA polymerázou během iniciace transkripce. Je to první místo, kde dochází k separaci DNA vláken.

                       Eukaryonta – nutná přítomnost promotoru a některých transkripčních faktorů

Transkripční faktor – protein, který má schopnost spouštět či jinak regulovat transkripci DNA. Funkční (transkripce, vývoj, kontrola buněčného cyklu, odpověď na signalizaci), strukturní (Leu zipy, zinkové prsty, helix-helix). Sekvenční homologie v DNA vazné doméně.

Komplex RNA polymerázy (II) a transkripčních faktorů (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIM) dávají dohromady tzv. preiniciační komplex nutný k tomu, aby transkripce začala.

Preiniciační komplex – bílkovinný komplex v chromatinu jaderných organismů, který je složený z několika transkripčních faktorů, jež se v uspořádaném sledu vážou na RNA polymerázu II a umožňují efektivní spuštění transkripce.

TATA box – sekvence DNA, který se nachází v promotorové oblasti mnoha protein-kódujících genů u jaderných organismů. Je to místo vazby tzv. TATA vazebného proteinu. Ten je součástí transkripčních faktorů, které vytvářejí preiniciační komplex a umožňují spuštění transkripce.

Regulace genové exprese – modifikace chromatinu. Aktivátory (transkripční faktor, nutný pro expresi genu), represor (vypíná expresi genu).

            Elongace – za první nukleotid RNA zařazuje a váže RNA polymeráza nukleotid další, vzniká tak krátký hybrid RNA-DNA. Poté se RNA polymeráza dává do pohybu od promotoru a působí lokální separaci a rozvinutí obou řetězců.

Nukleosidtrifosfát (NTP) – důležitý pro život, protože dodává stavební bloky DNA a RNA a také dodávají energii.

Tak jsou další a další místa matričního řetězce zpřístupňována pro přiřazování komplementárních ribonukleotidů, jež pak RNA polymeráza, v tom pořadí, jak se přiřadily k matrici, kovalentně váže. Směr pohybu RNA polymerázy určuje, který řetězec DNA bude transkribován. Matricový řetězec musí být čten vždy ve směru od 3´- 5´. RNA polymeráza je správně směrována orientací promotoru. Řetězec RNA narůstá vůči němu antiparalelně, tj. ve směru 5´- 3´. Rychlost asi 40 nukleotidů/sekundu, toutéž rychlostí je narůstající transkript DNA od svého matričního řetězce DNA oddělován. Hned nato se oba dočasně separované řetězce DNA spolu znovu spojují vodíkovými můstky a rekonstituují původní dvoušroubovici.

Korekturní čtení – oprava špatně poskládaných nukleotidů.

            Terminace – RNA polymeráza, rovnoměrně se pohybující po duplexu DNA, rozezná na jeho kódujícím řetězci místo, v němž již nemá být k vytvořenému řetězci RNA připojen další nukleotid, tzv. terminátor. V místě terminátoru je nasyntezovaná molekula RNA uvolněna z posledního dočasného spojení s kódujícím řetězcem DNA a duplex SNA je rekonstituován v plném rozsahu. Současně s novým řetězcem RNA opouští matrici i RNA polymeráza.

                       Prokaryonta – dvě strategie pro terminaci.

Intrinzní – mechanismus, který zapříčiní ukončení RNA transkripce a uvolnění nově vzniklé RNA. mRNA obsahuje sekvenci , která je schopná tvořit páry „sama se sebou“, čím vytvoří smyčku bohatou na cytosin a guanin. Za smyčkou se nachází část tvořená pouze uracilem. Bílkoviny navázaná na RNA polymerázu se váže na smyčku dostatečně silně, aby dočasně zastavila polymerázu, což souvisí s transkripcí sekvence uracilu. Slabá vazba mezi adeninem a uracilem sníží energii potřebnou pro destabilizaci mRNA-DNA duplexu, čímž dovolí mRNA se oddělit. Bez sekvence uracilu by nedošlo k oddělení a transkripce by pokračovala.

Rho-závislá (dependentní) – potřebuje bílkovinu Rho-faktor, která vykazuje aktivitu RNA helikázy k rozrušení komplexu mRNA-RNA-DNA. Váže se na vznikající molekuly RNA (do oblasti bohaté na cytosin). Spustí se hydrolýza ATP a Rho se začne pohybovat ve směru 5´à 3´ a začne dohánět RNA polymerázu. Když ji dožene, RNA polymeráza pustí vlákno a ukončí se transkripce. Díky helikázové aktivitě rozplete RNA-DNA komplex a uvolní RNA.

Eukaryonta – signál terminátoru je rozpoznán bílkovinnými faktory spojenými s RNA polymerázou II. Způsobuje ji sekvence opakujících se adeninových bází (poly-A) za posledním exonem.

RNA polymeráza II – bez konzervovaného místa či konstantní vzdálenosti, neporušená polyadenylace.

RNA polymeráza I – hlavní terminátor „downstream“ (k 3´konci) od rRNA prekurzorové sekvence.

RNA polymeráza III – na T-bohaté sekvence na 3´RNA konci.

            mRNA (mediátorová – translace, proteoxyntéza), tRNA (transferová – translace), rRNA (ribozomální – translace), hnRNA (heterogenní nukleární – prekurzor mRNA), snRNA (malá jaderná – regulace – vystřihování intronů), snoRNA (regulace), miRNA (micro – regulace (mohou se navázat na mRNA)), siRNA (small interferon – ovlivňuje expresi určitého genu), lnRNA (long non-coding – regulace transkripce (cílí na aktivátory, represory, RNA polymeráru II)).

            Podobnost s DNA replikací – přesná a účinná iniciace, elongace od 5´à 3´, přesná terminace.

            Odlišnosti – replikační počátky (prokaryo, eukaryo), více RNA polymeráz / buňku, pomalejší RNA polymeráza, nižší přesnost.

            Inhibitory – dvě skupiny antibiotik, specificky působící na podjednotky bakteriální RNA polymerázy. Rifamyciny blokují iniciaci, streptolydiginy inhibují elongaci.

            Reverzní transkripce – RNA viry mají ve svých virionech enzym, který umožňuje transkripci jejich genomové RNA do DNA à reverzní transkriptáza (RNA závislá DNA polymeráza). Tento enzym řídí v infikované buňce syntézu komplementárních vláken DNA na matrici řetězce virové RNA. Každé vlákno DNA se ovšem ihned od řetězce RNA uvolňuje. DNA polymeráza (nebo reverzní transkriptáza) k němu nasyntetizuje i komplementární vlákno = dvoušroubovice s geny RNA viru. Endonukleáza může přerušit obě vlákna DNA v některém chromozomu a včlenit virovou DNA (DNA ligáza to pospojuje).

Posttranskripční modifikace

            V prokaryontních i eukaryontních buňkách jsou řetězce RNA, vzniklé jako primární transkripty DNA, specificky upravovány. Teprve pak se stávají aktivními složkami proteosyntetického aparátu. Řetězce primárních transkriptů jsou zpravidla mnohem delěí než řetězce modifikovaných molekul mRNA, tRNA, rRNA. Současně jsou v eukaryontních buňkách k řetězcům primárních transkriptů připojovány navíc určité koncové sekvence nukleotidů, jež zůstávají připojeny i k mRNA. Dlouhé řetězce primárních transkriptů genů strukturních i genů pro rRNA a tRNA se obecně označují jako prekurzorová RNA (pre-m, t, rRNA).

            Pre-mRNA

Prokaryonta – transkripcí vzniká přímo zralá mRNA připravené k translaci. Každý prokaryontní transkript však nese vedle sekvence kódující na obou jejích koncích ještě sekvence nekódující, tj. transkript vedoucí sekvence DNA (předřazený kódující oblasti na jejím 5´konci) a transkript přívěsné sekvence DNA (přiřazený za kódující oblast na jejím 3´konci). Prokaryontní mRNA je často polycistronická, její řetězec nese v souvislém sledu transkripty několika strukturních genů.

Eukaryonta – sekvence DNA strukturních genů několikanásobně delší než sekvence z nich přepsaných molekul mRNA. Nadbytečné nukleotidové sekvence jsou uvnitř molekul. Znamená to, že kódující sekvence daného genu jsou přerušeny sekvencemi, jež se na kódování jeho genetické informace nepodílejí. Podle W. Gilberta nazýváme kódující sekvence exony a mezi ně vřazené sekvence, jež je navzájem oddělují, introny. Většinu eukaryontních genů tvoří geny složené (diskontinuitní), složené t exonů a intronů. Introny jsou často delší než exony. Přímým transkriptem je dlouhá molekula RNA, nesoucí v souvislém sledu sekvence komplementární všem jeho exonům i všem intronům. Tato prekurzorová mRNA se označuje jako jaderná heterogenní RNA (hnRNA). HnRNA musí být před translací transkriptů intronů zbavena a děje se tak procesem nazývaným sestřih (splicing). Nejdříve jsou transkripty intronů z hnRNA enzymaticky přesně „vystříhány“ a pak jsou exony přesně navázány těsně za sebe. Obsahuje transkripty vedoucí i přívěsné sekvence DNA. Dále získává charakteristické skupiny na obou svých koncích. Mechanismus sestřihu transkriptů genů, zejména strukturních genů jaderných, zatím není dosti jasný, podílejí se na něm molekuly malých RNA.

Spliceosome – drobná jaderná organela, v níž probíhá splicing. Tvoří ho snRNP částice (molekuly RNA s proteiny). SnRNP – U1, 2, 4, 5, 6

Ke každému řetězci hnRNA bezprostředně po jeho vzniku jsou v průběhu posttranskripční modifikace připojovány ještě další skupiny, resp. sekvence nukleotidů, jež nevznikly transkripcí a jež nejsou ani určeny k translaci. Na 5´konci je na volný 5´trifosfát prvního nukleotidu přivázán 5´-5´trifosfátovou vazbou (v opačné orientaci) nukleotid s guaninem. Takto vzniklá struktura se označuje jako čepička mRNA a vytváří substrát k metylacím. Všechny eukaryontní buňky metylují atom dusíku v poloze 7 terminálního guaninu (7-methylguanozin). Téměř všechny mnohobuněčné organismy váží další metylovou skupinu na 2´-O ribózy druhého nukleotidu. Některé váží ještě třetí metyl na 2´-O ribózy třetího nukleotidu. Každá eukaryontní hnRNA tedy dostává ihned po svém vzniku na 5´konec metylovou čepičku, přičemž stupeň její metylace je u všech organismů daného druhu konstantní. Metylová čepička přechází na mRNA a váže k jejímu 5´konci malou subjednotku ribosomu (ochrana a rozpoznání při translaci). Na 3´konec většina eukaryontních molekul hnRNA (a sekundárně mRNA) dostává jako přívěsek stereotypní sekvenci 100-200 adeninových nukleotidů, bývá často označována jako poly(A) přívěsek. Poly(A) sekvence nejsou zakódovány v RNA, jsou vytvářeny de novo katalytickým účinkem poly(A) adenylázy. Během životnosti mRNA se její poly(A) ohon postupně zkracuje (lze poznat „nové“ a „staré“ molekuly). S poly(A) sekvencí se za proteosyntézy specificky asociuje ribosomální protein, tento protein pak na ní zůstává vázán i po disociaci ribosomu (ochrana a export).

Konsenzuální sekvence – charakteristická a relativně konzervovaná sekvence bází DNA společná většímu počtu genů příbuzných funkcí nebo vykazující určitou evoluční homologii. Pojem se využívá i pro RNA a bílkoviny. Základním rysem je stálá přítomnost určitých bází v určitých polohách a společná či podobná funkce příslušné bílkoviny. TATA-box.

Trans-účinné faktory (proteiny), cis-účinné faktory (pre-mRNA sekvence).

Alternativní splicing – jev, při němž díky různým variantám splicingu z jednoho genu vzniká více bílkovinných produktů. Introny se vystřihují a exony je možné spojit různými způsoby. Je ponechán intron, je vynechán jeden exon.

Klinický význam

Familiární dysautonomie – recesivní, dědičná, mutace v místě splicingu.

Spinální svalová atrofie – recesivní, dědičná, poškozený regulační prvek.

Hutchinsonova-Gilfordova progerie – aktivace kryptického (skrytého) místa spolicingu

Malignity (zhoubná onemocnění)

            Pre-tRNA a pre-rRNA – Geny pro tRNA a rRNA jsou v chromosomech uloženy tandemově, tj. vždy ve více identických kopiích za sebou, oddělených navzájem mezerníkovými sekvencemi. Zmnožení genů, jejichž modifikované transkripty jsou finálními produkty, spolu s rychlou a opakovanou transkripcí všech kopií genu zajišťují, že buňka má vždy k dispozici dostatečný počet molekul každého typu tRNA i rRNA. Protože mezerníkové sekvence nejsou transkribovány, spočívá modifikace pre-tRNA ve vystřižení intronů a ve druhově specifické metylaci bází určitých nukleotidů. Ze všech řetězců pre-rRNA jsou „vystříhány“ výsledné molekuly jednotlivých typů rRNA, podrobeny sestřihu a zbývající sekvence jsou degradovány. Transkripce pre-rRNA a její modifikace zajišťují, že se všechny typy rRNA vytvářejí ve stejném množství, tj. v tom poměru, ve kterém je jich pro skladbu ribozomů potřeba.