24. Struktura lidského genomu, hlavní typy DNA

24. Struktura lidského genomu, hlavní typy DNA

Lidský genom je soubor veškeré DNA v lidské buňce. V jádře je uložena převážná většina: 3,2 miliardy párů bazí (bp), a to ve dvou kopiích (diploidní buňky). Uložen je na 46 chromozomech. Největší lidský chromozom 1 má velikost 250 Mb, což odpovídá délce molekuly 15 cm v rozbaleném stavu. Kdybychom veškerou genetickou informaci uloženou v jádře chtěli přepsat do knih, vznikla by knihovna obsahující tisíc knih velikosti Bible. [1]

Extrajaderný genom je u člověka pouze v mitochondriích - každá kruhová molekula DNA má velikost 16 596 bp. Ovšem v každé buňce je až několik set mitochondrií a v každé mitochondrii několik kopií její DNA.

Typy sekvencí v lidském genomu

Geny

Geny jsou úseky DNA kódující buď protein, nebo některý z druhů RNA. Jsou samozřejmě nejdůležitější částí lidského genomu, neboť obsahují informace esenciální pro život organismu. Současné odhady celkového počtu lidských genů jsou méně než 25 000. [2]

Geny jako takové tvoří až jednu čtvrtinu genomu, ovšem velkou většinu genů tvoří nepřekládané sekvence. Úseky kódující polypeptidy a RNA tvoří pouze 1,5 % genomu. [3]

Některé geny jsou v haploidním genomu jen v jedné kopii, naproti tomu mnoho genů se vyskytuje ve více kopiích - tzv. genových rodinách. Tyto skupiny genů jsou tvořeny geny s podobnou sekvencí, strukturou a funkcí. Předpokládá se jejich důležitá evoluční funkce. [4]Například genů pro syntézu tRNA je 10 - 100 kopií, pro histony až 50 kopií.

Pseudogeny

Pseudogeny (někdy též genové fragmenty) jsou zbytky genů, které během evoluce ztratily svůj význam. Jelikož nekódují žádný znak, nahromadily se v nich během vývoje mnohé mutace (neboť nepůsobil žádný selekční tlak proti mutacím). V některých případech mohou svou podobností s původním genem komplikovat genetická vyšetření.

Repetitivní sekvence

Jsou sekvence, které se v genomu opakují. Nekódují žádný znak. Rozeznáváme několik základních typů.

Rozptýlené repetitivní sekvence

Jsou jednotlivě rozptýlené po celém genomu. Patří mezi ně například sekvence Alu, která je asi 300 bp dlouhá a opakuje se v genomu asi 500 000x. Podobných sekvencí je celá řada a tvoří nejméně 30 % lidského genomu. Jsou zdrojem nehomologních rekombinací vedoucích k přestavbám genomu. Jejich množení je výsledkem reverzní transkripce.

Tandemové repetitivní sekvence

Jsou sekvence, jejichž opakující se kopie jsou v genomu těsně vedle sebe uspořádány. Podle délky opakující se sekvence se dělí na:

makrosatelitní sekvence - opakující se jednotka je dlouhá desítky pb. Vyskytují se zejména v okolí centromer.

minisatelitní sekvence - jednotka dlouhá 5 - 30 pb. Patří sem i telomerické repetice (TTAGGG).

mikrosatelitní sekvence - 2 - 4 pb dlouhé jednotky.

opakování jednoho nukleotidu - zejména A.

Variabilita lidského genomu

Obecný název pro různé sekvence v určitých částech genomu je varianta. Dříve se užívalo označení mutace pro formy, jejichž frekvence v populaci nepřesahovala 1 % (ovšem toto označení vzbuzuje dojem negativního působení na nositele), a polymorfismus pro formy častější. Pokud jde o varianty uvnitř lidských genů, mohou onemocnění způsobovat jak mutace v exonech, tak v intronech či promotorových sekvencích.

Výraz polymorfismy DNA se užívá pro popis variant v sekvenci DNA určitého lokusu na různých chromozomech a u různých individuí. Nacházejí se většinou v úsecích mezi geny, jen v menšině uvnitř genů. Jsou nepostradatelné při genetickém mapování diagnostice chorob a identifikaci jedince.

Molekulární podstata polymorfismů DNA

RFLP - restriction fragment length polymorphism, neboli polymorfismus délky restrikčních fragmentů, vychází z variant zasahujících rozpoznávací místo restrikčních endonukleáz. Pokud rozpoznávací místo zanikne, vznikne fragment delší, což je detekovatelné gelovou elektroforézou nebo Southernovou metodou. Delší fragment vznikne i v případě, pokud se mezi dvěma konstantními restrikčními místy vyskytne větší nebo menší počet tandemových repetic (většinou minisatelitních). V takovém případě mluvíme o VNTR - variable number of tandem repeats - polymorfismu.

STR, neboli short tandem repeats (mikrosatelity), jsou v genomu velmi časté a lze je velmi snadno detekovat pomocí PCR.

Bodové substituce beze změny rozpoznávacího místa jsou detekovatelné na DNA čipech, nazývají se SNP – single nucleotid polymorphism.

Pro DNA fingerprinting se používají zejména polymorfismy založené na různém počtu tandemových opakování, neboť obvykle nesou mnohem více alel než dvě a jsou v genomu časté.

Typy DNA

1. Jaderná (chromosomální)

Jádro buňky → chromosom → rozvlákněná DNA

Z funkčního hlediska se jedná o:

1.    DNA, která kóduje pořadí aminokyselin v polypeptidu nebo některé RNA.

2.    DNA, která má funkci kontrolní a řídící.

3.    Zvláštní typy DNA mají specifické funkce v chromosomech, např. v oblasti centromery a telomer.

4.    DNA, o jejíž funkci zatím nic nevíme.

U eukaryot přibližně 60 % DNA tvoří jedinečné (nebo málo se opakující) sekvence – patří sem například geny kódující polypeptidy nebo jim podobné nefunkční pseudogeny. Dalšími zastoupenými jsou repetitivní sekvence.

Dělíme je na:

1.     sekvence středně repetitivní– počet kopií v genomu 10–10⁵ (patří sem např. geny pro rRNA a bílkoviny typu histonů);

2.     sekvence vysoce repetitivní – řádově 10⁶ kopií / genom.

Repetitivní sekvence mohou být v genomu rozptýlené. Dlouhé repetitivní sekvence se označují jako LINE (Long Interspersed Nuclear Elements). Krátké repetitivní sekvence se označují jako SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). Většina SINE je odvozována od tRNA genů → jejich vznik je vysvětlován repozicí (přepisem) z RNA reverzní transkriptasou. Pro primáty jsou specifické tzv. Alu-sekvence, kdy téměř každý 4kb úsek lidské DNA obsahuje tuto sekvenci – jejich původem je 7SL DNA.Jinou možností jsou tzv. tandemové repetitivní sekvence, kdy jednotlivá opakování jsou za sebou – např.:geny pro rRNA či tzv. satelitní DNA.

2. Mimochromosomální

Mitochondriální DNA

U člověka se nachází v mitochondriích.Uspořádání genomu mitochondrií je odlišné od jaderného genomu eukaryotické buňky, ovšem je podobné uspořádání genomu u prokaryot. DNA má v mitochondriích cirkulárníuspořádání. U člověka má velikost 16,6 kb. V lidském genomu kóduje celkem 37 genů – z toho 24 genů se podílí na proteosyntetickém aparátu mitochondrií – geny 16S a 23S pro rRNA, 22 genů pro tRNA. Zbývající se podílejí na enzymatické výbavě mitochondrií. Většina genů je kódována na H (těžkém) vlákně DNA.Informace je poměrně silně komprimována, neobsahuje introny! Mezi další rozdíly patří, že má 4 triplety s rozdílným významem oproti těm v jadernému genomu, existují také rozdíly v iniciaci a terminaci.

Replikace

Replikace DNA je přenos informace z DNA do DNA. Je to tedy schopnost zajišťující dědičnost.

Obecná charakteristika

Při replikaci vzniknou z jedné mateřské molekuly DNA dvě naprosto stejné dceřiné DNA – každá s jedním vláknem z původní DNA, jedná se tedy o semikonzervativní proces, kdy nově vzniklá dvoušroubovice má vždy jedno vlákno původní a druhé vlákno nově syntetizované. Uplatňuje se při rozmnožování, kdy zajišťuje identitu genetické informace obou dceřiných buněk (pro rozmnožování je nezbytné, aby potomek dostal plnohodnotnou genetickou informaci). Rychlost replikace v živočišných buňkách se odhaduje na 0,5–0,15 μm/min, je to opravdu pomalý proces, proto probíhá na více místech současně.

Průběh replikace

Místa, kde dochází k replikaci, se nazývají replikony. Počet replikonů v buňce není konstantní, u rychle se množících buněk je jich více než u buněk množících se pomalu. Replikace neprobíhá na všech replikonech současně, obecně v replikonech lokalizovaných v heterochromatinu začíná později. Klíčovou roli při replikaci DNA mají enzymyzvané DNA polymerázy. U člověka se vyskytuje 5 druhů enzymů označovaných jako DNA-dependentní DNA-polymerázy (v živočišných buňkách pět typů).

Pro všechny typy DNA polymeráz platí:

§  Potřebují matrici = vlákno, ke kterému podle pravidel komplementace bazí vytvářejí doplněk;

§  při své práci vždy postupují od konce 5' ke konci 3';

§  potřebují mít k dispozici volný konec 3' nukleotidu, na který připojí fosfodiesterickou vazbou 5' místo nově zařazeného nukleotidu. Nově zařazované nukleotidy jsou používány ve formě nukleotidtrifosfátů, odštěpením dvou makroergních vazeb je získávána potřebná energie pro uskutečnění vazby;

§  DNA polymeráza nemůže zahájit syntézu de novo, ale připojuje pouze nový nukleotid na 3' pozici nukleotidu předchozího;

§  aby DNA polymeráza mohla zahájit připojování nukleotidů nového vlákna DNA, musí být vodíkové můstky (tj. nízkoenergetické vazby mezi oběma vlákny) nejprve narušeny enzymem helikázou.

Místa, která po narušení helikázou vzniknou, jsou označovány jako replikační počátky. Replikační počátky jsou tvořeny specifickými sekvencemi nukleotidů, které jsou rozpoznávány iniciačními proteiny. Pro snadné oddělování řetězců obsahují tyto sekvence vysoký podíl adeninu a thyminu. U bakterií bychom takovýto počátek našli pouze jeden.

Lidská DNA vytváří replikačních počátků okolo 10 000, to jí také umožňuje zreplikovat se v poměrně krátké době.Primáza (DNA-dependentní RNA-polymeráza) vytváří na začátku replikovaného úseku nového vlákna DNA krátkýRNA primer („očko“) – na jeho 3' konec může DNA polymeráza připojit první nukleotid nového vlákna DNA. Vzhledem k tomu, že jsou obě vlákna DNA antiparalelní(konci 5' jednoho vlákna odpovídá konec 3' vlákna druhého) a vzhledem k tomu, že DNA polymeráza syntetizuje „jednosměrně“ (od 5' k 3'), může souvisle probíhat replikace pouze na jednom vlákně.Na tomto vlákně tedy replikace (kterou provádí δ-polymeráza) probíhá rychleji a vlákno se označuje jako vlákno vedoucí.Na druhém (opožděném) vlákně probíhá replikace po částech – tzv. Okazakiho fragmentech ← replikace je zde pomalejší, je prováděna α-polymerázou, která má primázovou aktivitu.

Na procesu replikace se kromě uvedených DNA polymeráz podílí řada enzymů, jejichž úlohou je:

§  rozvinout suprahelikální strukturu – gyráza;

§  rozvinout Watson-Crickovu dvoušroubovici – helikázy.

Poté, co jsou k předlohovým (templátovým) vláknům dosyntetizována vlákna nová, je replikace DNA dokončena.

DNA polymeráza udělá 1 chybu asi na 10⁷ zreplikovaných bází (teoreticky mohou vznikat i dvojice G – T a A – C, jsou ovšem mnohem méně stabilní).Navíc má DNA polymeráza sama korekční funkci (v případě chyby provádí i opravu, spočívající ve vystřižení a zařazení správné báze), touto metodou jsou pravděpodobně odstraněna i očka RNA a pak enzym ligáza spojí jednotlivé fragmenty do souvislého řetězce.

Transkripce

Transkripce je přepis genetické informace z DNA do molekuly RNA. Jedná se v drtivé většině o přepis informace z jednoho genu, sloužícího k tvorbě jedné specifické bílkoviny, kterou buňka v danou chvíli potřebuje. Vlákno RNA se vytvoří na principu komplementarity k vláknu DNA.

Transkripční faktory

Transkripční faktory (TF) jsou proteiny, které se spolupodílejí na iniciaci transkripce (přepis dědičné informace z genu z DNA na RNA). Jejich prostřednictvím je genová exprese přizpůsobována potřebám buňky či celého organismu (např. hormony, hypoxie mohou stimulovat expresi – transkripci určitých genů).

Posttranskripční úpravy

Posttranskripční úpravy nastupují po úspěšném přepisu DNA do RNA.

Translace

Translace neboli protesyntéza je překlad nukleotidové sekvence mRNA do sekvence aminokyselinproteinu. Proces probíhá na ribosomech a jednotlivé aminokyseliny jsou zařazovány podle pravidel genetického kódu.

Posttranslační úpravy

Posttranslační úpravy nastupují po úspěšné translaci.