18.1

18. morfologické a biochemické charakteristiky programované buněčné smrti

            Apoptóza je jeden z hlavních typů programované buněčné smrti. Zahrnuje sled biochemických procesů vedoucích k typickým změnám vzhledu buňky (degradace cytoskeletu a následná změna tvaru cytoplazmatické membrány, smrštění buňky, fragmentace jádra i chromozomů uvnitř). Následně dochází k šetrnému odstranění zbytků této buňky (a nikoliv k zánětu), čímž se apoptóza v základech liší od nekrózy. Mezi apoptózou a nekrózou však není ostrá hranice a často se tyto jevy kombinují, čímž dochází k nejednoznačně pojmenovatelným typům buněčné smrti. Apoptózu lze v mnohých případech vnímat jako pozitivní proces, ke kterému například lidské tělo sahá v průběhu svého vývoje (vznik prstů). Apoptoticky však umírají i různé poškozené buňky, a to buď na základě „vlastního rozhodnutí“ samotné buňky (vnitřní cesta), nebo díky buňkám imunitního systému. Porucha apoptózy může u člověka způsobit poměrně široké spektrum onemocnění. Nadměrná apoptóza může vést k hypotrofii tkáně, naopak nedostatečná apoptóza může obecně způsobit nadměrné pomnožení buněk (až rakovina).

            Morfologické změny buňky – buňka procházející apoptózou se odlišuje od běžných buněk. Smrštění buňky, rozpad buňky na apoptotická tělíska.

Blebbing membrány – váčkovité výrůstky z membrány, způsobený rozkladem kortikálního cytoskeletu (tvořen aktinem a fodrinem). Na molekulární úrovni je vznik blebů způsoben ovlivněním činnosti Rho-guanozin trifosfatázy, načež dojde k ovlivnění aktin-myosinového systému buňky. Dojde k rozvlnění cytoskeletu (jeho odpojením od membrány).

Eat-me signál – změny ve struktuře membrány, např. vysunutí fosfatidylserinu na její vnější povrch. Označují apoptotické buňky určené k pohlcení fagocyty, čímž se aktivně předchází zánětu.

Propustnost mitochondriální membrány – vede k uvolnění cytochromu C. ten se účastní jako elektronový přenašeč v dýchacím řetězci buněčného dýchání. Jeho uvolnění z mitochondrií je však signál pro zahájení apoptózy.

Pyknóza chromatinu – kondenzace do kompaktních shluků načež proběhne karyorrhexe (tzv. internukleozomální štěpní DNA do relativně malých úseků) a následný rozpad jádra (karyolýza). AIF (apoptosis inducting factor).

            Funkce

Udržení rovnováhy – u dospělce je obvykle množství buněk v průběhu času relativně neměnné, a právě rovnováhu mezi buněčnou smrtí a buněčným dělením zajišťuje apoptóza. Když se buňky opotřebují či přestanou správně pracovat, jsou díky proliferaci okolní tkáně nahrazeny novými. Tato rovnováha je jedním z principů udržení vnitřní homeostázy, díky níž udržuje každý živý organismus své vnitřní prostředí v určitých limitech. Pokud je narušena, mohou se objevit dva základní druhy problémů: pokud se buňky dělí rychleji, než umírají, tkáň nadměrně bují a dochází k vzniku nádorů. Pokud se buňky dělí pomaleji, než umírají, výsledkem je porucha způsobená nedostatkem určitých buněk.

Usmrcení poškozených buněk – apoptóza se jako proces uplatňuje například v likvidaci poškozených buněk, buněk napadených virem nebo například nedostatečně zásobených živinami. Ionizující záření, které způsobí poškození DNA, může rovněž nastartovat proces apoptózy, stejně jako některé jedovaté látky. Obvykle se o to v těchto dvou případech stará protein p53, který tím zamezí jakémukoliv nádorovému bujení poškozené buňky. U téměř poloviny všech lidských nádorů je gen pro tento protein zmutovaný. Usmrcení poškozených buněk jsou schopné docílit mimo jiné T_C-lymfocyty, které v cílové buňce vytvoří pomocí perforinu otvory a pomocí granzymů a různých proteáz nastartují v dané buňce apoptózu.

Role ve vývinu a v dalších procesech – apoptóza se uplatňuje i ve vývinu mnohobuněčných organizmů, zejména ve formaci určitých složitějších struktur, jichž by se jinak špatně docílilo prostým buněčným dělením v určitém směru. Je to ale v menší míře, než se dosud uvažovalo. Díky skutečnosti, že při apoptóze dochází ke smrštění a fragmentaci buňky, může být tato velmi snadno fagocytována a jejich stavební látky mohou být opět tělem využity. Tvorba prstů, formování CNS, zmenšování prsou, umírání pokožkových buněk.

            Průběh – celý proces apoptózy buňky je spuštěn složitou soustavou různých látek. Tyto látky mohou být jak mimobuněčného původu, tak vnitrobuněčné, tedy produkované uvnitř buňky samotné. Z mimobuněčných molekul může apoptózu spustit vystavení buňky toxinům, hormonům, růstovým faktorům, NO a cytokinům. Tyto látky buď proniknou přímo do buňky, nebo spustí biochemickou kaskádu z vnější části cytoplazmatické membrány. Jmenované látky mohou jak spouštět, tak zastavovat apoptózu v cílové buňce (negativní i pozitivní účinek). Vnitrobuněčná cesta se spouští převážně ve chvíli, kdy je buňka v jakékoliv formě stresu, jako je vystavení glukokortikoidům, teplu, radiaci, nedostatek živin, virová infekce buňky, nedostatek kyslíku či také zvýšený obsah vápenatých iontů uvnitř buňky. všechny tyto jmenované signály jsou na počátku enzymatické kaskády, která je zodpovědná za provedení vlastní apoptózy.

Vnitřní cesta aktivace – některé skutečnosti, jako například poškozená DNA, jedy přítomné v buňce nebo oxidativní stres, mohou vyvolat vnitřní cestu aktivace apoptózy, která souvisí s mitochondriemi. Poškozením těchto organel se buňka vlastně vzdává poslední myšlenky na záchranu, protože mitochondrie představují nezbytné biochemické mašinérie, kde probíhá buněčné dýchání. Různé apoptotické proteiny (nebo možná i jiné látky, jako NO) se mohou na základě výše zmíněných situací uvnitř buňky navázat na mitochondrii a způsobit vznik pórů v její membráně nebo zvýšení její propustnosti, čímž dochází k vylití různých látek do cytosolu. Tyto látky mnohdy představují další článek v apoptotické kaskádě. Patří k nim tzv. SMACs (second mitochondria-derived aktivátor of caspases). Tyto se ihned navážou na proteiny, tzv. IAPs (inhibitory apoptotických proteeinů), deaktivují je a IAPs tím ztrácí svou schopnost bránit dalšímu pokračování apoptotické kaskády. Následně je aktivována skupina cystein proteáz, tzv. kaspáz, které způsobí vlastní degradaci buňky. Z mitochondrií se však nevylučují jen SMACs, ale protože se vytvoří ze speciálních molekul MAC (mitochondrial apoptosis-induced channel) v membráně mitochondrií určité kanály, může skrz membránu ven uniknout i cytochrom c, protein, který se normálně podílí na transportu elektronů při buněčném dýchání. V tomto případě však funguje jako další z řady aktivátorů, protože se váže na protein Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) a za pomoci ATP také na prokaspázu-9. Z jmenovaných proteinů vzniká velký komplex zvaný apoptozom, který je schopný měnit prokaspázu-9 na kaspázu-9. Proteinový kanál MAC je ovlivňován množstvím proteinů, jako je Bcl-2 (bránící apoptóze), případně proteiny ced-9 u háďátka c. elegans. Bcl-2 proteiny jsou schopné regulovat apoptózu buď právě pomocí kanálu MAC, nebo nepřímo pomocí jiných proteinů, případně dokonce i poté, co cytochrom c už unikl z mitochondrie.

Vnější cesta aktivace – vnější cesta aktivace apoptózy začíná na cytoplazmatické membráně, konkrétně na několika, zvaných „receptory smrti“. Na tyto receptory se vážou různé ligandy, jako je TNF (tumor necrosis factor) či Fas ligand. Receptory jsou v podstatě oba ze skupiny TNF receptorů (TNFR). TNF je cytokin produkovaný zejména aktivovanými makrofágy. Vazba TNF na jeden z receptorů má za následek aktivaci kaspáz, a to přes určité prostředníky (FADD – Fas-associated protein with death domain). Fas receptor se po navázání na Fas ligand změní na tzv. DISC (death-inducing signaling complex), který aktivuje kaspázu-8 a kaspázu-10. Kaspáze-8 pak obvykle aktivuje další kaspázy (3, 7), které nevratně směřují k smrti buňky. Fas ligandy se uplatňují ve velké roli v imunitním systému, protože se nachází na povrchu T_C-lymfocytů a mohou tak indukovat apoptózu u vybraných buněk. Mimoto mají tyto T-lymfocyty rovněž Fas receptor, který se může navázat na Fas ligand na té samé buňce a způsobit tak řízenou apoptózu opotřebovaných T-lymfocytů. Nádorové buňky toho někdy využívají, jelikož mohou obsahovat na svém povrchu Fas ligand, a tak mohou indukovat buněčnou smrt u T-lymfocytů, jejich „protivníků“. Zvláštní způsob apoptózy, naprosto nezávislý na kaspázách, řídí molekula AIF (apoptosis-inducing factor).

Závěrečná fáze – přestože cest vedoucích k apoptóze je více, existuje jeden hlavní mechanismus, jehož úkolem je provedení apoptózy jako takové. Po přijetí signálu totiž jsou aktivovány proteolytické enzymy, tzv. kaspázy. Kaspázy jsou cysteinové proteázy (enzymy rozkládající proteiny), které štěpí na karboxyskupině kyseliny asparagové. Tzv. iniciační kaspázy katalyzují štěpení dalších druhů kaspáz a na konci tohoto řetězce vznikají tzv. exekutorové kapsázy. Exekutorové kaspázy se vážou na tzv. substráty smrti, mezi něž patří proteiny cytoskeletu, proteiny řídící opravu DNA, proteiny zabraňující apoptóze apod. V konečném důsledku vzniká z buňky několik váčků, tzv. apoptotická tělíska. Umírající buňky, které podstoupily závěrečnou fázi apoptózy a změnily se na apoptotická tělíska, vystavují na svém povrchu různé molekuly vyzývající k jejich pozření (fagocytóze). Mezi tyto signály patří například fosfatidylserin. Tato molekula je v normální buňce pouze na vnitřní straně membrány, ale během apoptózy se přemísťuje na vnější stranu. Fosfatidylserin a jiné molekuly označují buňku, aby mohla být pohlcena, a to buď okolními buňkami, nebo buňkami imunitního systému (makrofágy).

            Biochemické změny – změněné vlastnosti buněčné membrány – externalizace fosfatidylserinu.

Změněná struktura a funkce cytoskeletu – tradiční pohled je že mikrotubuly se neúčastní, ale asistují při rozpadu jádra a buněčných fragmentů a mohou pomáhat při udržení membránové integrity umírající buňky – blokádou kaspázy-3. Mikrofilamenta – aktivní remodelace apoptických buněk – ztráta adherence, blebbing. Střední filamenta – podílí se na fragmentaci).

Aktivace proteáz – kaspázy – cysteinové-aspartamové proteázy – u lidí 14 typů, zymogeny – prokaspázy. Iniciační – 2, 8, 9, 10, 12. Exekuční – 3, 6, 7. Aktivace = fosforylace prokaspázy a štěpení.

Další proteázy v buněčné smrti – fragmentin/granzym (T_C-lymfocyty), kalpainy (kalcium dependentní), katepsiny (lysozomy), DNAázy (CAD – kaspázou-3-aktivovaná DNAáza).

            Aktivace apoptózy – rodina BcL-2 (Bax, Bik, Bad, Bcl-xS) – B-cell lymphoma

            Inhibice apoptózy – rodina Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1).

            Autofagie (lysozomální smrt) – nedostatek živin, chemoterapie, infikované makrofágy, axotomy (neurony), retinální degenerace. Na kaspázách nezávislá, chybí kondenzace chromatinu, masivní vakuolizace cytoplazmy (autofaické vakuoly), uvolňování ATP, externalizace fosfatidylserinu, velmi malé či žádné pohlcování fagocyty in vivo.