15.1

15. fluorescence a její aplikace v biomedicíně

            Fluorescence je fyzikálně chemický děj, který je typem luminiscence (spontánní záření nějakého předmětu, které vyzařuje jako přebytek záření tělesa nad jeho tepelným zářením). Luminiscence se dále dělí na elektroluminiscenci, fotoluminiscenci, radioluminiscenci a chemiluminiscenci. Fluorescence patří mezi fotoluminiscenční záření, které je vyvoláno buď účinkem jiného dopadajícího záření, které je vyvoláno buď účinkem jiného dopadajícího záření, nebo účinkem dopadajících částic.

            Původ jevu – původ luminiscenčního záření je v atomech, popřípadě v molekulách látek. Pro pochopení fluorescence je postačující představa modelu atomu, který počít s tím že elektrony obíhají jen po určitých drahách – orbitalech. Každý orbital představuje určitou hladinu energie potřebnou pro udržení elektronu v obalu. Čím je orbital vzdálenější, tím více energie na udržení je potřeba, a naopak tím menší energie je potřeba na jeho odtržení. K vlastní luminiscenci dochází prakticky jen pokud se atom nachází ve vybuzeném stavu (excitovaném). Jedná se o stav, kdy dochází k absorpci energie dopadajícího záření nebo dopadajících elektronů. Energie atomu se následně zvyšuje, jelikož obíhající elektrony předcházejí do vzdálenějších orbitalů. Na základě kvantového modelu atomu nemůže mít atom libovolnou energii a jednotlivé energetické stavy tvoří nespojitou řadu, z čehož vyplývá, že atom musí přijímat energii po kvantech. Vyšší energetické stavy jsou nestabilní a atom/atomy se po určité době vracejí do svého stabilního ustáleného stavu. Časový interval návratu do základního stavu bývá většinou velmi krátký, přebytečná energie je vyzářena v podobě kvanta zářivé energie – fotonu.

Principy fluorescence – fluorescence j sekundární záření, které je charakterizováno vyzářením energie ve velmi krátké době, řádově 10^-9 s až 10^-6 s. Emitované záření je vyzářeno atomem, který energii pohltil. Fluorescence nese svůj název podle minerálu fluoritu neboli kazivce (CaF₂), u kterého byl tento jev poprvé pozorován. U anorganických sloučenin je fluorescence pozorována zřídka (soli vzácných zemin, sloučeniny uranylu apod.). Častěji je tedy možné fluorescenci pozorovat u organických látek, z nichž nejčastěji využívanými jsou sloučeniny obsahující aromatické cykly.

Charakteristiky – intenzita (počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času), spektrální složení (spektrální hustota fotonového toku na jednotkový interval vlnových délek nebo frekvencí), polarizace (směr kmitání elektrického vektoru elektromagnetické vlny), doba dohasínání (je dána vnitřní dobou života excitovaného stavu, z něhož dochází k emisi; úzce souvisí s pochody vedoucími k nezářivé deaktivaci tohoto stavu), koherenční vlastnosti (vztahy mezi fázemi světelných vln).

            Excitační spektrum – spektrum vlnových délek, při kterých dochází k excitaci.

            Emisní spektrum – spektrum vlnových délek, které atom emituje po excitaci.

Fluorescenční barviva – fluorescenční barviva (fluorofory, fluorochromy) jsou chemické sloučeniny, které obsahují ve své molekule reaktivní skupinu, která je schopna reagovat s nukleofilními skupinami (NH₂, OH, SH). Obecně se fluorofory dělí na vnitřní (vlastní) a vnější (nevlastní).

Vnitřní fluorescence – vnitřní fluorescence buněk je dána přítomností vnitřních fluoroforů, mezi které patří proteiny (GFP), redukované formy NADH a NADPH, vitamin A, cytochromy, peroxidáza, hemoglobin, myoglobin či chlorofyl. Proteiny vyzařují fluorescenční záření v UV oblasti spektra. Hlavními fluorofory v proteinech jsou aromatické aminokyseliny (fenylalanin, tryptofan, tyrosin), jejichž absorpční i emisní pás leží mezi 240 a 300 nm. Ostatní uvedené látky vyzařují ve viditelné oblasti spektra (modrá, žlutá či červená).

Vnější fluorescence – vnější fluorofory jsou používány mnohem častěji než vnitřní. Jsou přidávány ke studovanému vzorku a podle typu vazby jsou děleny na fluorescenční značky a fluorescenční sondy. Vnější fluorofory se dálě dělí do dvou skupin podle kvantového výtěžku fluorescence. Fluorescenční barviva používaná v klasické fluorescenční cytochemii (fluorescein, akridinová oranž, …) jsou látky jejichž kvantový výtěžek fluorescence se nemění po přidání ke studovanému vzorku. Do druhé skupiny patří látky, kde kvantový výtěžek závisí na bezprostředním okolí fluoroforu.

Fluorescenční značky – nejčastěji se používají k fluorescenčnímu značení proteinů, ke kterým se vážou kovalentní vazbou. V některých aplikacích je také využívána vazba biotin-avidin, kdy je studovaná molekula (receptor, polynukleotid, polysacharid atd.) označena biotinem a poté je detekována fluorescenčně značeným avidinem. Nejznámějšími fluorescenčními značkami jsou FITC (fluorescein-5-isothiokyanát) a TRITC (tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát). FITC je barvivo s absorpčním maximem při 495 nm, maximální fluorescencí při vlnové délce 519 nm (zelený). Nevýhodou je, že jeho citlivost je značně ovlivněna hodnotou pH. Další nevýhodou všech derivátů fluoresceinu je jejich poměrně snadná forodestrukce. BODIPY tyto fluorofory obsahují atomy bóru. Mají vysoký kvantový výtěžek fluorescence, poměrně široké emisní spektrum a nejsou závislé na polaritě prostředí a pH.

Fluorescenční sondy – jsou to vnější fluorofory, které se váží ke struktuře nekovalentní vazbou a často při tom mění své fluorescenční vlastnosti. Tyto fluorofory jsou používány ke studiu změn konformace bílkovin, tloušťky membrán, membránového potenciálu apod. Pro FISH jsou nejdůležitější sondy pro nukleové kyseliny. Je známo, že nukleové kyseliny nefluoreskují, nebo jen slabě. K identifikaci a vizualizaci chromozomů se používá akridinová oranž, ethidium bromid, DAPI. Nejznámější a také nepoužívanější fluorescenční sondou pro vizualizaci veškeré jaderné DNA je DAPI (modrý). Dalším často používaným fluoroforem je akridinová oranž. Jedná se o fluorescenční sondu, jejíž absorpční a emisní pásma se liší podle substrátu, ke kterému je vázána DNA/RNA.

            Využití – fluorescence je v medicíně nejčastěji využívána jako principiální prvek některých laboratorních analytických metod. Přístroje, které jsou založené na měření fluorescence, se rozdělují do čtyř typů:

Spektrofluorimetry – měří střední signál celého vzorku umístěného obvykle v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky

Fluorescenční mikroskopy – umožňují pozorovat fluorescenci dvojrozměrných nebo trojrozměrných mikroskopických objektů. Využití fluorescence v mikroskopii se stalo základem právě fluorescenční mikroskopie, která nachází široké uplatnění zejména v medicíně a v oblasti přírodních věd. pokud kupříkladu na jednu protilátku navážeme fluorescein (emituje zelené světlo při excitaci modrým světlem) a na jinou rhodamin (emituje červené světlo při excitaci žluto-zeleným světlem), pak můžeme porovnávat vzájemné pozice různých molekul ve stejné buňce apod.

Fluorescenční skenery (včetně čteček mikrodestiček) – měří fluorescenci dvojrozměrných makroskopických objektů (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy).

Průtokové cytometry – měří fluorescenci velkého množství jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich subpopulací.